단백질 동정은 일반적으로 bottom-up 방법을 사용하지만 다양한 변형이 있는 단백질의 분석과 같이 전체 단백질 특성 분석이 필요한 경우 top-down sequencing같은 동정 방법이 필요하다. 상대적으로 덜 복잡한 단백질 혼합물의 분리의 경우, top-down 방법은 빠르고 직접적으로 sequencing에 대한 정보를 얻을 수 있다. Top-down sequencing은 intact protein의 질량을 결정함으로써, 손상되지 않은 단백질의 fragmentation이 수행되어 단백질 서열뿐만 아니라 위치 및 구조의 잠재적인 변형 또는 돌연변이를 정확하게 확인 할 수 있는 방법이다. maXis는 분자량이 큰 단백질의 분자량을 ppm 수준까지 정확하게 결정 할 수 있으며, glycosylation pattern을 포함하여 정확한 amino acid의 1차 구조를 확인 할 수 있다. ETD (Electron Transfer Dissociation)의 도입으로 PTMs를 포함한 intact protein에 대한 직접적인 MS/MS로 단백질의 1차구조 확인 및 PTMs의 동정을 가능하게 할 수 있다.

Figure 1. Innovative new technical developments on the maXis ETD for enhanced analytical performance.

maXis-ETD의 응용 분야 중 하나는 monoclonal antibodies와 같은 바이오 의약품에 대한 규제 승인이다. 작은 공정상의 차이가 약물의 안전성과 효능에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있기 때문에 완벽한 표준화와 비교 기준이 필요하다. ETD를 통한 추가적인 Top-down 분석으로 Intact protein의 질량을 분석할 수 있으며 이를 통해 단백질 약물이 정확하게 제조되고 정제되었는지를 확인할 수 있다. 또한 시퀀스의 세부정보 및 modification을 신속하게 탐지해 낼 수 있다. ETD에서 펩타이드 또는 단백질의 fragmentation는 라디칼 음이온으로부터 전자 전달에 의해 라디칼 양이온으로 전환시킴으로써 유도된다. 생성된 분석물의 양이온 라디칼은 불안정하며 일반적으로 단백질 또는 펩타이드의 c- 및 z-형 fragmentation인 N-Ca 결합을 자른다. 이 과정은 아미노산 back born을 따라 무작위로 발생한다. PTMs은 각각의 아미노산 상에 존재하며 인접 피크 사이의 질량 차이에 의해 ETD-MS/MS 스펙트럼을 통해 관찰할 수 있다. Bruker사의 maXis™ UHR-TOF LC-MS는 high resolution, high accuracy(sub ppm level)의 데이터를 제공한다.

높은 질량 정확도와 분해능의 결합은 MS spectrum 내에서 정확한 동정을 가능하게 하며, 추가적인 ETD는 보다 상세한 단백질의 fragmentation pattern을 관찰 하여 PTMs 동정의 효율을 높여준다. 이러한 특징은 maXis가 top-down 분석의 이상적인 장비임을 시사한다.

	CHO cell로부터 IgG를 얻었고 2.1 x 30mm, C8 3.5um 컬럼을 통하여 15분 gradient로 분리한 뒤 maXis로 직접 분석하였다.
	Reducing 및 alkylation 과정을 거쳐 intact IgG가 HC, LC로 분리 되었으며 이를 2.1 x 30mm, C8 3.5um 컬럼을 통하여 분리 및 maXis를 이용하여 분석하였다.
	E. coli는 C4 150X1mm 칼럼으로 30 ℃에서 180μl/min의 유속으로 분리되었다.
	Ubiquitin 및 Serotransferrin은 Sigma Aldrich에서 구입하였다.
	ETD MS/MS의 경우 모든 단백질을 0.1 % Formic acid를 포함한 50:50 메탄올/물로 제조한 용매를 사용하였으며 3mL/min의 속도로 이온화시켰다.