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본 연구는 추출 또는 정제와 같은 시료 준비 없이 탈착 전자 분무 이온화 질량 분석법 (DESI-MS)을 사용하여 인간 유두종 바이러스 (HPV) DNA를 신속하게 검출하는 새로운 접근법에 대해 설명하고 있다. 이는 제한 단량체 다형성 (RFMP) 분석에서 올리고 뉴클레오타이드를 이온화 및 검출하기 위해 대기압하 이온화 질량 분석법을 사용하고 올리고 뉴클레오타이드의 다중 하전된 이온의 조합으로부터 HPV 유전자형을 빠르게 식별하는데에 목적이 있다. DESI-MS의 스프레이 용매 시스템은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 생성물의 복잡한 혼합물을 세척하는 단계에 사용하여 시료 처리 없이 올리고 뉴클레오타이드를 검출 할 수 있다. 이 연구는 DESI-MS를 이용한 HPV DNA 기반의 RFMP 분석을 검출하고 유전자형을 결정함으로써 자궁 경부암의 신속한 진단이 이루어진 결과를 소개하고 있다.
지속적인 인간 유두종 바이러스 (HPV)는 전세계적으로 여성의 유방암에 가장 흔한 암인 자궁 경부암의 주요 원인으로 알려져 있다. 조기 발견을 위한 스크리닝 도구로 사용되는 HPV 유전자형검사는 보다 정확하고 신뢰도 있는 방법이 필요한 상황이다.
최근 자궁 경부암 진단을 위해 GeneMatrix Inc. 에서 제한 절편 다형성 (RFMP) 분석을 이용한 HPV 유전자형 분석이 개발되었다. RFMP는 핵산을 이용한 표적 증폭 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS)을 이용한 유전자형 특이적 올리고 뉴클레오타이드 조각의 질량 검출에 기반을 두고 있다. 유전자형 특이적 모티프를 포함하는 HPV DNA의 제한 절편은 두 개의 7mer, 두 개의 12mer 및 두 개의 13mer의 고유 서열을 가지며, 분자량은 모든 HPV DNA 유형에 따라 다르다.
MALDI와 달리 DESI (desorption electrospray ionization)는 대기압 하에서 수행되며 시료 전처리가 거의 필요 없으며, 고체 또는 응축된 시료의 분석이 가능하므로 화학 물질에 대한 중요한 정보를 샘플 손상 없이 제공한다. 또한 측정 후 바로 질량을 확인할 수 있어 매우 신속한 방법이라고 할 수 있다. DESI-MS는 대사 산물, 의약품, 생물학적 조직 질량 분석 이미징 등 다양한 분야에서 높은 처리량을 가지는 탁월한 장비이다.
본 연구에서는 DESI-MS를 이용하여 HPV genotyping에 대한 RFMP 분석을 실시하여 자궁 경부암 진단 가능성을 검증 하였다. DESI-MS를 이용한 PCR (Polymerase Chain Reaction) 샘플로부터 DNA를 검출하는 접근법을 찾는 초기 단계는 어렵지만 샘플 솔루션 최적화를 통해 MALDI와 ESI 실험 모두를 아우를 수 있다. DESI-MS로 측정한 결과를 이론 질량과 비교하여 분석 한 결과 샘플을 정제하지 않고 대기압 하에서 HPV DNA 기반 RFMP 분석을 검출하였고 자궁 경부암을 신속하게 진단 할 수 있었다.
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materials
HPLC grade methanol, acetonitrile (ACN) 및 deionized
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Ammonium citric dibasic (DAC) and ammonium acetate (AA) |
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HPV DNA 유형 16, 18 및 58의 합성 올리고 뉴클레오타이드 |
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임상 HPV DNA 샘플 |
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합성 올리고 뉴클레오타이드 샘플 (100μM)을 12 % ACN에 용해시키고, 12 % CAN에 10mM AA 또는 10mM DAC를 첨가 하였다. |
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3μL의 샘플을 소수성 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 (PTFE) 표면 (Prosolia Inc., Indianapolis, IN, USA) 위에 올려 놓고 실온에서 건조시켰다. |
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실제 샘플은 12 % ACN 1 mL에 재현성을 보였다. |
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샘플을 정제하지 않고 사용 하였다. |
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3 μL의 샘플을 PTFE 표면에 점적한 뒤 실온에서 건조시켰다. |
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2D DESI 소스(Prosolia Inc.)가 장착된 Thermo Finnigan LTQ 선형 이온 트랩 질량 분석기로 수행하였다. |
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Fused-silica spray emitter (I.D. 50 ㎛ 및 O.D. 150 ㎛)를 샘플 표면에 약 55 °의 각도로 장착 하였다. |
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DESI 파라미터 조건: tip-to-sample distance of ~1.5 mm, a tip-to-inlet distance of ~4 mm, an inlet-to-sample distance of ~0.5 mm, and a tip length of 1 ~ 1.5 mm. |
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80 % 메탄올 용매를 유속 3μL/min, 분무 전압 4 kV로 분무 하였다. |
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분무기 가스 (질소) 압력은 100 psi, 모세관 온도는 300 ℃로 설정 하였다. |
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MS 입구 모세관 전압 및 튜브 렌즈의 전압은 각각 -10 및 -120V로 설정하였다. |
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최대 이온 주입 시간 100 ms와 1 microscan 대해 스펙트럼을 수집하도록 설정되었으며 스캔 모드에서 연속적으로 수행하였다. |
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모든 질량 스펙트럼을 음이온 모드에서 얻었으며 Xcalibur 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 처리 하였다. |
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