용매 선택은 DESI의 분석 성능을 결정하는 핵심 요소이므로 세 가지 유형의 합성 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 실험조건을 최적화하였다. ACN은 시료와 표면 사이의 소수성 상호 작용을 감소시키는 데 사용되는 일반적인 용매이므로 DESI에서 탈착을 향상시켜주는 역할을 한다. HPV DNA의 합성 올리고 뉴클레오타이드는 12 % ACN 용액에만 용해시키고, [M + Na] + 및 [M + K] +의 강도를 감소시키기 위해 DAC 및 AA를 첨가하였다.

그림 1은 합성 DNA 유형 16의 DESI 질량 스펙트럼을 보여주고 삽입 그림은 샘플 로딩 스팟을 보여준다. 흰 점은 합성 샘플에 불순물이 포함되어 있지 않다는 의미이다. 12 % ACN에 용해 된 시료의 질량 스펙트럼에서 DNA 이온 신호는 염 이온 간섭이나 높은 백그라운드 신호 없이 잘 측정되었다. (그림 1 (a)).

10 % AA를 12 % ACN (그림 1 (b))에 첨가한 경우의 질량 스펙트럼 패턴은 그림 1(a)와 매우 유사한 반면에 용액에 10 mM DAC를 첨가하면 DNA 이온 신호를 억제하고 그림 1(c)와 같이 백그라운드 신호 수준이 높아지는 것으로 나타났다. 이는 분무 용액에 탈염 물질을 첨가하는 것은 분석 물질 이온 신호를 억제하거나 DESI 실험에서 백그라운드 신호를 증가시키는 것과 같이 효과가 없거나 부정적 효과를 주는 것을 의미한다.

실제 시료를 분석하기 위해 용매 조건을 적용하였고 DESI-MS에 의한 HPV 유전자형 분석을 위한 RFMP 분석에 대한 초기 접근을 위해 우리는 3가지 고위험 HPV DNA 자궁 경부암을 일으키는 모든 HPV 유전형의 70 %를 차지하는 대부분의 환자에서 16, 18, 58 형이 검출됐다는 것을 관찰하였다. HPV DNA는 자궁 경부 환자의 임상 표본에서 수집되었다.

그림 2는 HPV DNA 유형 16, 18 및 58의 두 가지 DESI 질량 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 2(a) - (c)와 같이 높은 백그라운드 간섭으로부터 올리고 뉴클레오타이드 이온 신호를 정확하게 구별하기가 어려운 것을 볼 수 있다.

약 2분 동안 용매를 시료 표면에 분무 한 후 분석한 결과 HPV DNA 유형 16, 18 및 58 각각에 대해 그림 2(d) - (f)와 같이 이온 신호가 나타나기 시작하고 백그라운드 간섭이 감소하였다. 그림 2의 삽입 그림에 표시된 샘플 지점은 그림 1의 무색 합성 올리고 뉴클레오타이드와 달리 빨간색인 것을 볼 수 있는데, PCR에서 얻은 실제 DNA 샘플에는 프라이머, 완충 용액, PCR 부산물 및 나트륨 염과 같은 많은 불순물이 들어 있기 때문이다.

중합체로 간주되는 불순물은 임상 HPV DNA 샘플 질량 스펙트럼의 양이온 모드에서 측정되었지만, 이들 이온 신호는 합성 올리고 뉴클레오타이드 샘플에서 측정되지 않았다(미도시). 오염은 DNA 분석의 주요 장애물이므로 PCR 산물에서 이를 제거하기 위한 많은 방법이 개발되었다. 에탄올은 염 양이온을 함유한 용액에서 물과의 상호 작용을 막기 위해 DNA를 침전시키는데 사용된다. 메탄올을 시료 위에 뿌리고 샘플 표면의 불순물을 씻어내어 DNA 분자를 침전시키고 농축 할 수 있다.

샘플 스팟의 붉은 색이 사라지면 DNA 분자가 검출되기 시작한다. 스프레이 용매가 실제 샘플 상에 존재하는 간섭 물질을 씻어내면 올리고 뉴클레오타이드가 용매에 잘 용해되기 때문에 이온 신호가 나타나기 시작한 것으로 생각되며, 샘플로부터 생성된 분석물 이온이 MS에 도달하여 탐지된 것으로 보인다.

표 1은 RFMP 분석에서 HPV DNA 유형 16, 18 및 58의 서열 및 이들의 분자량을 나타낸다. RFMP 분석에서, FokI 및 BtsCI 제한 효소는 이 효소의 절단 부위가 증폭 프라이머에 끼어들어간 인식 부위의 말단이기 때문에 특별한 스펙트럼을 만든다. HPV 유전자형은 HPV L1 유전자에서 22개의 염기쌍 유전자형 특이적 모티프로부터 유래된 올리고 뉴클레오타이드의 분자량 차이를 이용하여 나타낸다. 4 HPV DNA 유형 16 (그림 2 (d))의 DESI 질량 스펙트럼에서 6개의 올리고 뉴클레오타이드를 충전한 상태는 -3에서 -9까지이다. 흑색 삼각형(▲)으로 표시된 [M-4H] 4- 및 [M-3H] 3-에 상응하는 질량 대 전하 비 (m / z) 543.6 및 724.8에서 7mer (ACAATA)의 뉴클레오타이드가 검출되었다. TGGCATT 올리고 뉴클레오타이드(Δ)는 각각 [M-5H] 5-, [M-4H] 4-, [M-3H] 3-에 상응하는 m / z 437.7, 546.9, 729.7에서 검출되었다.

두 개의 12mer 올리고 뉴클레오타이드 -TTTCCTTACCCC (□) 및 TGTTGGGGTAAC (□)는 또한 -4 내지 -9의 전하 상태 (m / z 922.3, 737.6 614.6, 526.7 및 409.9)를 갖는 다수의 음전하를 갖는 분자 이온 및 - 5 ~ -6 (m / z 758.7 및 631.9)로 검출되었다. 전하 상태 -4 ~ -8 (m / z 1000.9, 800.3, 666.8, 571.5 및 499.9)및 ?4 ~ ?5 (m / z 999.8, 799.8)는 마이너스 다중 전하 분자 이온으로 검출된 두 개의 13mer 올리고 뉴클레오타이드 -AACAAATGCCATT (●)와 CAACTATTTGTTA (○)이다. HPV DNA 유형 18 및 58의 질량 스펙트럼을 각각도 2(e) 및 (f)에 나타내었고, 다중 하전된 분자 이온의 m / z 값은 유형 16에서와 같이 6개의 기호로 표시 하였다. 고도로 다중 하전된 이온의 경우, 피크가 서로 겹치고 피크 오버랩으로 인해 약 1Da의 질량 오차가 있었기 때문에 이들을 구별하기가 어려웠다. 질량 분해능이 높은 질량 분석기는 높은 전하 이온의 보다 정확한 m / z 값을 제공 할 수 있다. 본 실험의 DESI 질량 분석기는 1Da 이상의 낮은 분해능을 가지고 있지만 HPV DNA genotypes15의 서열로 이미 알려진 올리고 뉴클레오타이드는 여러 개의 다중 하전된 이온의 조합으로 지정할 수 있다.

본 연구에서는 RFMP 분석에 근거한 HPV 유전자형 분석을 위한 잠재적 분석 기법을 제시하였다. DESI의 용매 분사는 두 가지 역할을 하는 것으로 밝혀졌다: PCR 불순물이 들어있는 DNA 샘플을 추가로 정제하고 표적 올리고 뉴클레오타이드를 이온화한다. DESI 실험시 에탄올 침전과 같은 DNA 정제 단계는 필요하지 않다. 3가지 HPV DNA 유형 16, 18 및 58의 결정은 탈착 전자 분무 스프레이 기반 이온화 방법에서 잘 생성된 다중 전하 분자 이온의 질량 값을 결합하여 성공적으로 분석할 수 있었다.