FIGURE 2. Orbitrap Fusion and the Easy of Use Instrument Method Editor.

Improved Metabolomics Workflow

Metabolite Profiling과 ID를 위한 전통적인 Workflow는 Full scan LC/MS 실험에 이어 Targeted MS/MS Confirmation을 이용하여 확인하는 것을 기본으로 한다.

혁신적인 Orbitrap Fusion 질량분석기와 mzCloud Library에 의해 위와 같이 개선된 Workflow를 만들었다. 실험은 UHPLC Timescale에서 HCD MS/MS는 Full Scan MS와 동시에 수행되고, 동시다발적으로 CID 와 HCD를 Ion Trap 과 Orbitrap으로 ddMSn Ion Tree 데이터를 얻었다. 새로운 구조를 확인하는 것에 있어서 찾고자 하는 성분이 Library에 없을 경우 Spectral Tree와 유사한 정도를 바탕으로, Precursor Ion Fingerprinting (PIF) 알고리즘을 이용하여 자동화된 Fragmental Peaks의 주석을 통해서 손쉽게 확인할 수 있다.

Metabolite Identification Requires High Resolution and Isotope Ratio Measurements
Mass Spectrometry에 의한 미지시료의 구조적인 해석은 많은 연구자들의 주요 관심사 중에 하나이다. 첫 번째 결정적인 단계는 정확한 Elemental Compositions 정보를 얻는 것이다. 자연적으로 생성되는 원소는 Monoisotopic (F, Na, P, I) 또는 Polyisotopic (H, C, N, O, S, Cl, Br)이다. L-Methionine(C₅H₁₁NO₂S)이 포함하고 있는 Multiple Polyisotopic 원소 중, S의 경우 분해능 240,000(at m/z 200 (FWHM))에서 Multiple Isotopic Peaks을 분리해서 볼 수 있다. 그림 3A는 분자 이온 [M+1+H]+ 의 Isotope Pattern을 나타낸다. 분해능이 증가할수록 특히, 분해능 450,000 (FWHM)에서는 이론적으로 보여야 할 다섯개의 모든 Isotope Peak이 뚜렷하게 분리되어 측정되었다. 그림 3B는 분자이온의 이론적인 Isotope Pattern을 계산한 스펙트럼이다. 이처럼, 정확한 Elemental Composition 정보를 확인하기 위해서는 정확한 분자량뿐만 아니라 고분해능을 바탕으로 한 Multiple Isotopic Peaks까지 파악할 수 있어야 정확한 정보를 얻을 수 있는 것이다.

FIGURE 3. Ultrahigh resolution resolves the isotopes

Metabolite identification and quantitation in complex sample requires high resolution
Human Blood에 있는 D-Glucose(C₆H₁₂O₆)와 Paraxanthine(C₇H₈N₄O₂)이 5300 μM (D-Glucose) vs. 10 μM (Paraxanthine) 농도로 잔류할 경우이다. 비록 D-Glucose가 백배 이상 농도가 높더라고 이온화 효율이 낮기 때문에 실제로 MS에서 검출되는 감도는 낮을 수 있다. 이들의 질량값은 0.0013 amu (179.0561 vs. 179.0574)만큼 차이가 있고, 이들을 정확하게 구분해서 검출할 수 있는 것이 매우 중요하다. 그림 4는 분해능 240,000 이상에서 200 μM (D-Glucose)과 1 μM (Paraxanthine)이 쉽게 분리될 수 있는 것을 보여준다.

FIGURE 4. Ultrahigh resolution resolves isobaric metabolites. Metabolite Identification Requires High Accuracy of Mass Measurement in both MS Full Scan Level and MS/MS Level

Unknown Metabolite는 가능성 있는 분자식이나 구조적인 이성질체의 다양한 Candidate 수를 고정확도의 질량값과 MSn의 데이터를 이용하여 정확히 줄여 나갈 수 있다. 아울러, Orbitrap Fusion은 Internal Calibration(Easy IC) 기능이 포함되어 있다. 그림 5는 Internal Calibration없이 소변 샘플로부터 L-Tryptophan 의 LC-MS/MS 데이터를 얻은 것과 IC를 적용해서 Sub-ppm의 정확한 질량값의 MS와 MS2데이터를 얻은 것을 보여준다.

FIGURE 5. Easy Internal Calibration

FIGURE 6. Rapid ion tree acquisition on UHPLC timescale from a urine sample (1 MS, 2 MS2 and 4 MS3 in 0.6sec/cycle).

(A) m/z 181.0721의 Ion Trap HCD MS2과 Orbitrap CID MS3 데이터를 얻었다.

Orbitrap Fusion은 Metabolite의 Isotope Ratio를 초고분해능으로 이론적인 값과 동일하게 데이터를 제공한다. 이것은 복잡한 샘플 속에서 폭넓게 분포되어 있는 Metabolite를 분리하고 측정할 수 있게 해준다. Easy-Internal Calibration 은 물질의 연구와 관련하여 최종적으로 정확도가 높은 신뢰가 가는 결과를 쉽게 제공한다. HR/AM인 Orbitrap Fusion은 빠른 시간 내에 보다 많은 구조적인 정보를 해석할 수 있게 도와준다. mzCloud Library는 MS2 와 MSn의 자동화된 방식으로 대사산물을 확인하는데 이용할 수 있다. 다중 MS Spectral Tree와 PIF 알고리즘은 Unknown Metabolite와 이성질체들을 보다 쉽고 빠르게 ID할 수 있게 도와주므로, 이 연구에서는 더욱 효과적인고 개선된 Metabolomics Workflow를 제시했다고 볼 수 있다.