C-SIG (Cellular Signal Integration Group) 랩에서 24/7/365 동안 새로운 질량분석기 소스인 Nano-ESI 소스를 테스트 해 본 결과, Peptide와 Protein ID가 20% 증가된 것을 확인했다. C-SIG 랩은 Thermo Scientific™ EASY-Spray™ Nano-Electrospray Ion Source를 출시하기 전에 테스트해본 전세계적으로 몇 안되는 랩 중 하나이다. 이 새로운 이온화 소스는 그들이 사용하고 있던 Thermo Scientific Q Exactive™ Mass Spectrometer에 설치해서 테스트했다.
Erwin M. Schoof, Ph.D.은 Technical University of Denmark (DTU), Department of Systems Biology에서 Large-Scale Mammalian Cell Biology와 Cancer Research를 구축했다. 전이암에서 키나아제에 의한 단백질 인산화에 대한 연구는 이 학과에서 주요 연구주제 중 하나이다. “암환자의 죽음은 90%이상 전이(Metastais)가 원인이며, 우리는 이것을 예방하고 멈추는 방법을 찾고 있다.”고 Schoof는 말했다. “키나아제는 암에서 주요 활동을 하는 것으로 알려졌다. 그들은 인간 게놈에서 538 키나아제와 비슷하고, 전세계적으로 약 75%의 제약 R&D에서 인산화 활성을 제어하기 위한 약물 표적화 키나아제 연구를 겨냥하고 있다. 일반 암세포와 전이세포는 특히 그들의 인산화 과정(Phosphorylation Dynamics)에서 결핍 제한(Dys-Regulated)되는 경향이 있다.”

약물 표적화된 단일 키나아제를 대신해서, 연구실의 주요 연구자인 Professor Dr. Rune Linding은 전이암의 세포 신호표시를 포함한 키나아제의 네트워크에 관한 연구를 하고 있다. 목표는 주어진 네트워크 상태에서 전이와 관련된 다중 키나아제에 대한 치료법과 결합해서 생각하는 것이다. 치료를 목표로 하는 단일 키나아제는 Signaling Network내에서 양자택일 방식으로 번식하는 것에 의한 세포의 저항력이 증가할 때 종종 그 효력이 상실된다.
실험실 내 분석 시스템의 많은 유형들 중, 이들의 연구 분야의 대 부분이 Q Exactive Mass Spectrometers를 이용하고 있고, 전세계적으로도 큰 비중을 차지하고 있다. EASY-Spray Source는 그들의 Q Exactive 장비 중 하나와 처음으로 설치하여 테스트 한 것이다.

Schoof가 말하길, “나는 비싼 샘플들을 질량분석기를 이용하여 한달하고 반동안 측정하고 있다. 나는 실리적인 이슈에만 맞춰서 실험을 하지 않는다. 우리는 데이터의 일관성이 필요하며, 데이터의 재현성에 영향을 주는 컬럼을 교체나 다른 하드웨어적인 부분을 교체할 수 없다. 재현성은 생물학적인 타당성에 관해 데이터의 질을 높이기 위해 많은 반복 실험을 하기 때문에 중요하다. 한가지 염려되는 상황은 샘플이 측정되는 동안 컬럼이나 Emitter의 교체가 필요할 때이다. 컬럼을 교체하고도 Spray Efficiently를 이전과 동일하게 얻을 수 있는 방법은 없을까? 늘 동일하게 용리되는 크로마토그램을 얻을 수 는 없는가? 샘플을 변질 시킬만한 Downtime이 있는가? 만약 이 새로운 소스가 안정적이고 우수한 데이터를 만들어 줄 수만 있다면 이 소스로 시도해 보겠다.”

EASY-Spray nano-Electrospray Ionization Device

EASY-Spray Source로 인해 결과가 최적화되고 재현성있게 구축되었다. EASY-Spray는 그림 1에서와 같이 Plug-and-Spray Nano-Electrospray ionization (ESI) device로 UHPLC와 MS사이를 Nanobore Tubing으로 연결할 수 있게 하나의 Union형태로 연결되어 있다. 온도 컨트롤이 가능한 컬럼(50cm), High-Voltage Electrode와 Emitter는 EASY-Spray 컬럼에 하나로 연결되어있다. Thermo Scientific Dionex™ NanoViper™ fitting은 쉽고 빠르게 손으로 조일 수 있고, Thermo Scientific EASY-nLC 1000 또는 UltiMate™ 3000 RSLCnano System과 같은 Nano UHPLC System을 이용할 경우 1000bar 이상에서 Solvent가 새는 현상이 없다. Source 끝부분의 Emitter는 이온화된 샘플을 Thermo Scientific Orbitrap Elite™, Q Exactive, Velos Pro™과 같은 질량분석기로 이동시킨다.

No Fiddling Required

“소스의 설치는 정말 간단하다- LC와 질량분석기 사이를 컬럼으로 바로 연결하게 되어 있다. 이 소스를 설치 한 다음에 데이터를 분석해 보니, 기존에 사용했던 분석장비에 소스만 교체 했을 뿐인데도 Protein과 Peptide ID가 무려 20%이상 증가했다. 정말 감동 그 자체였다!”라고 Schoof는 전한다. (그림 2)

“EASY-Spray는 질량분석기의 기술적인 면에서 오는 복잡한 절차를 덜어주는데 크게 도움을 준다. 만약 시퀸싱 도중에 컬럼이나 Emitter를 교체한다면, 예상컨대, 이 소스를 이용할 경우, 큰 지연과정 없이 동일한 조건의 질적으로 우수하고 재현성을 가진 데이터를 얻을 수 있다. 현재 이 소스의 컬럼오븐은 전 시간에서 매우 안정적으로 온도가 적용이 된다. Easy-Spray는 Emitter와 컬럼 사이를 연결해야 되는 과정이 필요 없다. Emitter의 위치는 항상 동일하다.”

Easy-Spray Source로 얻은 Total Ion Current(TIC)는 이전에 Manual Spray Source로 얻은 것 보다 훨씬 안정적이다. 만약, 내가 세달 동안 샘플을 측정할 필요가 있다면, 나는 기술적인 면에서 오는 최소한의 어려움 때문에 의해 동일한 데이터를 얻기가 힘들다. 그래서, 생물학적인 면에 초점이 맞춰져 있는 우리로써는 이러한 기술적인 면에 가장 관심이 많다. 이것이 내가 새로운 것을 시도해 보는 것을 좋아하는 가장 큰 이유이다. 만약 EASY-Spray 사용 중에 어떠한 잘못된 점을 발견하여 컬럼 교체를 해야 한다 할 지라도, 나는 간단히 한두 개 샘플을 테스트 한 뒤 Easy Spray는 매우 안정적이어서 중요한 샘플들을 연이어서 계속 분석할 수 있다. 실험자에게 있어 유쾌한 경험이었다.

Large-Scale Colon Cancer Research

실험실은 2007년, 영국 런던에서 설립되었고, 발전 평가 능력에서 최초로 집결 되었다. 그들의 flag-ship algorithms NetworKIN과 NetPhorest (http://NetworKIN.info and http://NetPhorest.info)은 키나아제의 기능과 다른 Domains간의 심도 있는 이해를 위해 상이한 소스로부터 상관관계를 알아본 것이다. “단백질의 긴 서열을 얻기 위한 데이터는 한가지다.” 고 Schoof는 말했다. “하지만 이러한 단백질의 기능을 결정하고 근본적으로 생물학적인 질문의 해답을 위해서 우리는 보다 나은 분석 장비들이 필요하다. 이러한 질문의 해답을 돕는 알고리즘과 MS로부터 분석한 데이터, High-Throughput Cell Imaging과 같은 다른 소스로부터 얻은 데이터를 모두 통합해야 한다.“
새로운 게놈 스케일의 생물공학을 창시하고자 실험실을 2011년 덴마크로 옮겼고, 기본과 번역 연구에 기반을 둔 Llarge-Scale Network Biology를 관리하기 위한 분석 장비들을 모두 갖추었다.
Professor Dr. Linding 지휘 아래, 많은 다른 프로젝트 중 colon cancer 전이 연구는 매우주목받고 있는 연구분야이다. 세포와 초기 환자 샘플을 Q Exactive를 이용하여 Phospho-Proteomic 데이터를 정량 분석했다. 그들의 알고리즘을 이용하여 상이한 질병상태 사이에 다르게 활동하는 키나아제를 예측할 수 있었다. Schoof가 말하길, “우리는 인산화 과정을 정확하게 결정 할 순 있지만, 키나아제와 기질간에 높은 전이의 상호작용 때문에 키나아제는 관측된 인산화 반응이 즉각적으로 실험적인 것과 Large Scale을 직접적으로 일치시키기는 어려웠다.” 라고 말했다. 하지만, 반면에 Schoof Group은 실험과 예측된 키나아제가 phenotype을 가져올 수 있는 양적인 시그널의 네트워크를 포함한 알고리즘을 결합함으로 해서 이런 문제를 해결해 나갔다.

계속해서, 그들은 발견된 Phenotype에서 그들의 활동을 기능적으로 평가하기 위해서 Follow-Up Cellular과 in vivo Perturbation 연구를 통해 구성된 네트워크를 평가하고자 상세히 논의하고 테스트했다. 이렇게 하여, 그들은 암전이와 같은 질병을 야기하는 단백질 네트워크에 관해 보다 정확한 이해를 할 수 있었다. 즉, Cell-Line Data와 실제 환자 샘플데이터를 접목하여, 보다 나은 임상의 적절성(Clinical Relevance)을 가져올 수 있었다. 이것은 향후 임상의 연구에 도움이 되고, 치료법의 용병학 발전을 가져올 것이다. 이 실험실의 계획은 대량의 샘플을 분석하기 위해 그리고, 이들의 어려운 실험을 수행하기 위해 필요한 질량분석기법을 사용하기 쉽고, 재현성이 좋은 결과를 얻는 방향으로 발전시키는 것이다.