2) Targeted Active-Site Peptide MS Method Development and Acquisition
Probe들을 이용하여 농후화된 시료에서 활성효소의 활성자리에 대한 펩타이드의 상대적인 양을 Pinpoint Software 이용해 펩타이드 신호들의 넓은 Dynamic Range를 밝혀냈다. 더 풍부한 활성자리 펩타이드들은 HR/AM Full-Scan MS를 사용하여 정량하였다. 극미량의 Intensity가 낮은 펩타이드들은 펩타이드 이온의 Signal Intensity를 향상시키기 위해 Multiplexed SIM (msxSIM)로 선별되었다. Q Exactive 질량분석기의 주요한 장점은 Orbitrap에서의 이온을 검출하는 동안 이온의 C-traping이 동시에 가능하다는 것이다(Figure 4A & B). 이 기능으로 선택된 이온들이 가두어짐과 동시에 검출함으로써 Cycle시간을 크게 줄이게 된다. 이 장점은 Targeted Multiplexed SIM가 예정되었을 때, 다중의 Targeted 이온들을 동시에 가둠으로써 더욱 배가된다. Orbitrap이 검출하는 동안, C-trap은 순차적으로 좁은 질량 범위로 정의된 이온들로 채워진다. 본 실험은 최대 4개의 Mass Windows 까지로 Multiplexing을 제한하였지만, MS Method상에서는 10개 질량 범위까지 이온을 모아 동시에 분석하는 것이 가능하다. Full-Scan MS와 msxSIM 사이의 Cycling은 Target Selectivity을 유지하는데 사용된다. Full-Scan MS와 msxSIM 사이의 교환과 같은 이러한 접근 방법은 ULK3 활성효소 활성 자리 펩타이드인 NISHLDLKPQNILLSSLEKPHLK의 Targeted 분석에 응용되었다(Figure 4C). 1.2초 동안 Full-Scan과 SIM 모드로 얻어진 모든 데이터들은 좁은 범위의 Retention time이 Centroid 모드에서 보여진다. Full Scan 모드에서의 XIC(Extracted ion chromatogram) 구성을 보면 ±5 ppm의 Mass Tolerance를 사용하여 필터링했음에도 불구하고 많은 수의 피크들을 볼 수 있다. 이 강조된 부분은 Base Peak의 Intensity가 단지 3%였음에도 Targeted 활성 자리 펩타이드에 대한 예상되는 용출 시간을 포함하고 있다. XIC Profile은 SIM event에 대한 예정된 Targeted 데이터 획득 방법이 간섭없이 분명하게 관심물질의 피크를 측정한다는 것을 보여준다. SIM event를 다중화(Multiplexing)함으로써, ULK3 단백질의 활성부위 펩타이드와 동일한 Retention Tme에서 동시에 분리된, 2개의 추가 활성 부위 펩타이드의 선택적인 데이터 획득을 용이하게 였다. Full-scan MS scan에서의 많은 수의 백그라운드 이온에도 불구하고 3개의 Target m/z값을 msxSIM Window에서 쉽게 획득할 수 있었다. SIM event의 다중화는 ULK3 활성자리 펩타이드의 동일한 Retention Time Window에서 동시에 분리되는 (Co-eluted) 두 개의 추가 활성자리 펩타이드에 대한 선택적인 데이터 획득을 용이하게 한다(Figure 5A).

Figure 4. The Q Exactive mass spectrometer (A) is capable of multiple C-trap filling during Orbitrap detection (B) and producing a multiplexed spectrum (C).

Full-scan MS scan에서 보여지는 많은 수의 Background 이온들에도 불구하고 3개의 Target m/z값을 msxSIM Window에서 쉽게 획득된다. Target m/z값에 근사한 m/z값을 가진 이온을 Quadrupole Mass Filtering함으로써, Target 펩타이드 Precursor Ion의 더 많은 축적을 가능하게 하였다. Figure 5B는 Full-Scan MS, SIM, 이론적인 Isotopic 분포에서 좁은 질량범위의 중심에 있는 NISHLDLKPQNILLSSLEKPHLK +4 Precursor의 m/z 값을 보여준다. Full MS Scan와 SIM Scan 모두에서 이 펩타이드와 동시에 분리된 +3 Charge State의 매트릭스 이온을 확인했다. 그러나, 고해상도의 Orbitrap 질량분석기는 20%의 상대적인 Intensity에서 Matrix Ion과  A+2 Target Isotope의 질량 차가 단지 0.05 Da (76 ppm)일지라도 Background 신호들로부터의 분리를 용이하게 한다. SIM event 역시 Full-scan MS와 비교하여 Target 펩타이드 동위원소들에 대하여 증가된 신호들과 더 정교한 구조를 제공한다. 각 펩타이드들은 독립된 Target MS² 실험을 통해 분석하였다. Target msxSIM과 Target MS² 실험에서 뛰어난 Retention Time 상관관계가 관찰되었다(데이터 첨부 생략).

고 분해능과 정확성은 Full-scan MS와 msxSIM MS분석에서 선택적으로 Target 이온을 유지하기 위해 또한 사용된다. Pinpoint Software는 Isotopic XIC마다 잠재적인 Background 간섭을 밝힐 수 있다. Figure 6C는 NISHLDLKPQNILLSSLEKPHLK 펩타이드의 +4 그리고 +5 Precursor Charge States에 대한 실험적인 값과 이론적인 값들 사이에서의 Isotopic 분포의 겹쳐짐을 보여준다. Charge States에 대한 내적 상관계수(Dot-Product Correlation Coefficients)는 각각 0.95와 0.98이다. 일관된 피크 모양과 상대적인 Isotopic 분포는 매트릭스 Background가 아닌 Target 펩타이드에서 기인한 측정된 신호들에 대한 신뢰도를 증가시킨다. Figure 6D는 모든 생물학적 상태들과 반복실험에 대한 +4 Charge State에 관하여 통합된 히스토그램이다. 계산된 상관계수(Correlation Coefficients)는 모든 파일에서 0.95 이상이었고, 이는 외부적으로 보정된 질량의 정확도가 샘플을 분석하는 동안 유지되었다는 것을 가리킨다.

3) Kinase Inhibitor Profiling and IC₅₀ Determination
Full-scan MS와 앞서 서술한 msxSIM 방법을 통합해 사용하면, 다중의 샘플들 또는 처리 조건에 따라 발현한 활성효소의 상대적인 양이 꾸준히 평가될 수 있다. 활성효소 억제제 Profiling은 약물 처리 전과 후에 활성효소 활성자리 펩타이드의 상대적인 양의 변화를 측정함으로써 효과적인 실험방법으로 평가될 수 있다.  억제제 결합 친화도 또한 용량 반응 곡선(Dose Response Curve)으로부터 IC50 값을 결정하기 위해 억제제의 농도를 적정함으로써 확인될 수 있다. 억제제의 농도가 증가할 때 억제된 활성효소 펩타이드의 신호가 감소되기 때문에 Targeted msxSIM 획득 방법은 이런 연구에 획기적인 분석방법이 된다.
Figure 7은 광범위한 특이성을 가진 활성효소 억제제인 Staurosporine의 양을 증가하여 처리한 샘플을 msxSIM 방법으로 처리하여 측정한 동시에 분리된 3개의 활성 자리 펩타이드를 상대적으로 정량 분석한 것을 보여준다. Figure 7A는 두 번의 기술적인 반복 실험에서 샘플 당 각각의 Targeted 펩타이드에 대한 겹쳐진 XIC을 도표화한 것을 보여준다. GCK 활성효소(DTVTSELLAAVKIVK)와 ULK3 활성효소 (NISHLDLKPQNILLSSLEKPHLK)는 모두 0.1 mM 미만의 Staurosporine을 처리하였을 때 충분히 억제를 보인 반면, PKR 활성효소(DLKPSNIFLVDTK)는 Staurosporine을 처리에 대하여 미미한 억제를 보인다. 용량 반응 곡선(Dose Response Curve)을 도표화하고 각 활성효소에 대한 IC₅₀ 를 계산하는데 상대적인 펩타이드 신호 Intensity가 사용되었다(Figure 7B). Staurosporine 활성효소 억제 Profiling을 위해, 종합적인 데이터가 몇몇 대체 분석방법에서 또한 사용될 수 있고, 기 연구된 결과로부터 얻어진 값들과 매우 유사하다.

Figure 6. Data processing strategy using Pinpoint software for HR/AM MS and msxSIM data where (A) shows the individual isotopic XIC plots in centroid display mode, (B) shows an overlaid XIC plot for retention-time determination, (C) shows the isotopic distribution overlap between experimental and theoretical profiles for each charge state, and (D) shows the resulting isotopic distribution for all resulting RAW files acquired in the study.

Figure 7. Targeted msxSIM analysis for low-level co-eluting active-site peptides. Comparative overlaid XIC plot at each titrated staurosporine level (A). Dose-response curves of the measured peptide signal inhibition as a function of titrated staurosporine concentration with calculated IC50 values for each active-site peptide (B).

Table 3은 Staurosporine을 처리한 후 본 연구법에서 정량 분석한 모든 활성효소를 나열한 것이다. 처리한 Staurosporine(10 μM) 샘플들을 처리하지 않은 Staurosporine과 상대적인 Intensity와 비교함으로써 그들의 활성효소들은 억제 퍼센트(%)에 의해 그룹화되었다. 이 분석은 어떤 활성효소가 Staurosporine과 결합하는지 명확하게 보여주고 공통의 억제를 보이는 활성효소의 아과(Subfamily)를 분석하기 위해 사용될 수 있다.

Table 3.Identified kinases (active-site peptides) and corresponding relative quantitation determined using HR/AM MS data after inhibitor treatment. Kinase peptides measured using targeted multiplexed SIM are shown in bold.

Thermo Scientific ActivX Desthiobiotin-ATP와 Desthiobiotin-ADP Probe 기술과 Q Exactive LC-MS 분석은 전반적인 활성효소 동정과 약물 억제 Profiling을 가능하게 하는 최적의 Workflow을 만들어 냈다. 이와 같이 새로운 활성 부위 Probe는 ATP 합성효소의 아과(Subfamily) 개체들을 특이적으로 잡아냈고 억제제 선택성 Profiling과 결합 친화도 측정에 대한 활성효소 MS 검출을 향상시켰다. HR/AM Full-scan MS와 msxSIM events를 결합한 고유한 데이터 획득 방법은 스펙트럼 라이브러리를 만들고 Target 활성효소 활성자리 펩타이드를 만드는 데 사용될 수 있다. Multiplexed SIM event는 Background에 비해 7배 신호들이 향상된 활성효소 활성부위 펩타이드가 LC에서 동시에 분리되었을 때에도 Cycle 시간을 최대화 하는데 사용되었다. 이러한 향상된 Dynamic Range는 IC₅₀ 계산을 위해 필요한 낮은 농도의 펩타이드 정량 분석을 가능하게 하였다. 나아가, 통합된 소프트웨어는 분석시간을 줄이기 위해 자동화된 방법 구축과 데이터 Processing을 더 용이하게 하였다. 이 Workflow은 Q Exactive와 LC에서 60분의 Gradient를 사용함으로써, 126개가 넘는 활성효소의 억제에 대한 활성부위 펩타이드의 정성분석과 정량분석을 하는데 성공적으로 사용되었다.