Kinase 활성사이트 Probe를 이용하여 스타우로스포린(Staurosporine)에 의한 Kinase Inhibitor에 관하여 Targeted SIM과 msxSIM으로 정성 분석 및 정량 분석을 한다.

다수의 복잡한 세포들의 기능 및 과정들과 관련되어있는 단백질 활성효소는 중요한 효소이다. 단백질 활성효소의 탈 통제나 돌연변이는 종양 형성을 포함한 수 많은 질병 현상에 기저가 되기 때문에 약품개발에서 이상적인 후보물질이 된다. 그러나 500개 이상의 활성효소들의 아과(Subfamily) 개체들 사이의 높은 상동성 때문에 구체적으로 활성효소 억제제들을 분석한다는 것은 매우 도전적인 일이다. 더욱이, 세포들의 신호체계에서 활성효소의 기질특이성의 중복과 혼선은 체내에 있는 활성효소 억제제들을 분석하기 위한 시도들을 당혹스럽게 할 수 있다. 활성효소 억제제 Target들을 분석하는 최신기술은 활성효소 억제제의 특이성과 결합친화성 같은 화학적 단백질 유전정보 자료수집에 기초한다. 이 기술은 억제하는 동안의 활성효소 활성부위의 결합을 알아내기 위해 저 분자 탐침의 결합 및 농축을 가지고 질량분석에 기초한 정성분석과 정량분석을 함께 병행한다. 이러한 방법들 중 한가지는 활성효소 ATP 결합자리의 보존된 라이신(Lysine) 잔기들과 되돌이킬 수 없는 반응을 하는 비오틴이 부착된(biotinylated) 새로운 ATP와(또는) ADP Probe를 사용한다. 표시된 활성효소 소화물들로부터 활성자리 펩타이드들의 선택적인 농축은 적은 양의 활성효소 펩타이드들을 질량분석하기 위한 신호들을 증가시키고 매트릭스들을 급속도로 감소시킨다. 이 방법을 사용함으로써 다양한 포유류 조직들과 세포계로 부터 400개 이상의 다양한 단백질 활성효소와 지방 활성효소들을 분석할 수 있고 이온 트랩 질량분석기에서 지정한 획득을 사용하여 기능적으로 평가할 수 있다. 이 분석은 ActivX Biosciences에서 KiNativ™Kinase Profiling Services을 통하여 상업적으로 이용이 가능하다.
본 실험의 접근은 Desthiobiotin-ATP와 Desthiobiotin-ADP Probe를 Hybrid Quadrupole-Orbitrap(Q Exactive) 질량분석기와 함께 활성효소 분석과 활성효소 억제에 관한 세계적인 분석을 위한 통합적인 작업흐름으로 포함시켰다(Figure 1).

Figure 1. Integrated workflow of sample preparation/enrichment, data acquisition and data processing for global kinase identification and drug inhibition profiling.

본 연구에서 사용한 Workflow는 높은 분해능과 정확성을 위한 Orbitrap의 이온획득 일반 모드(Full Scan Mode)와 Targeted 모드에서 MS스펙트라와 MS/MS스펙트라의 획득하는데 있어 현존하는 장비 중에 가장 탁월한 결과를 얻을 수 있음을 보여준다. 복합적인 데이터 획득 방법은 장비의 회전율을 최대화하고 Nano-LC 시간에서 SIM(Selected Ion Monitoring)을 통해 적은 양의 활성효소 펩타이드들을 정량하기 위하여 쓰인다. 전반적으로 이 접근법은 활성효소의 활성자리 펩타이드을 검출하고 활성효소 억제제 Profiling을 위한 상대적인 정량분석에 대하여 상당히 향상된 결과를 이끌어냈다.

1) Sample Preparation
K562 백혈병 세포들 (ATCC)은 10% FBS가 보충된 RPMI 매체에서 성장시켰다. 세포 용해물(1 mg)은 Thermo Scientific™ 7K Zeba™ Spin Desalting 컬럼과 Thermo Scientific ActivX™ Desthiobiotin-ATP 또는  Desthiobiotin-ADP로 표시되어 있는 5 μM의 Probe들을 이용하여 앞에서 언급했던 바와 같이 십분 동안 용출시킨다. 억제제 Profiling을 위해, Desthiobiotin 뉴클레오타이드 Probe가 더해지기 전에 세포 용해물은 0, 0.01, 0.3, 1, 3 그리고 10 μM의 Staurosporine에 미리 처리한다. 표시한 단백질들은 줄어들고, 알킬화되고 용출되며 트립신(Trypsin)에 의해 분해된다. Thermo Scientific High-Capacity Streptavidin Agarose Resin을 이용하여 두 시간동안 포획된 Desthiobiotin로 표시된 펩타이드들은 MS분석을 위하여 50% Acetonitrile/0.4% TFA으로 흘려주면서 분리했다.

2) LC-MS
모든 분리는 Thermo Scientific EASY-nLC™ Nano-HPLC을 가지고 수행했고 Solvent A는 DW with 0.1%FA, Solvent B는 ACN with 0.1%FA를 사용했다. Magic™ C18 충진 물질로 충진된 150 x 0.075 mm Capillary Column이 분당 0.57% gradient (5%–45%)로 실온에서 300 nL/min flow를 주며 실험했다.  Thermo Scientific Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량 분석기로 Data-Dependent 또는 Targeted 방식으로 샘플들을 분석하였다. 자세한 질량분석기 Method는 Tables 1. 과 2.에 요약하였다.

Table 1. Mass spectrometer parameter settings used for discovery experiments.

Table 2. Mass spectrometer parameter settings used for targeted experiments.

3) Data Analysis
Thermo Scientific Proteome Discoverer™ Software Version 1.3은 International Protein Index (IPI) Human Database와 대조적으로 SEQUEST^® and Mascot^® search engines을 사용하여 MS/MS Spectra를 찾는데 사용했다. 시스테인(Cysteine) 잔기를 변형하기 위해 Carbamidomethyl (57.02 Da)을 사용하였다.
라이신(Lysine)과 메티오닌(Methionine) 잔기들에 각각 Desthiobiotin (196.12 Da)변형과 Oxidation을 Parameter로 설정했다.
Database Search 결과는 고분해능과 고정확성(HR/AM)질량분석기 레벨의 정량분석을 위해 Thermo Scientific Pinpoint™ Software Version 1.2에 사용했다. Targeted 펩타이드마다 가장 풍부한 4개의 Isotopes을 바탕으로 하여 데이터를 추출했다. AUC(Area Under the Curve) 값들은 총 AUC값들로 합하여진다.