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Nano Stick, PDA UV-Vis Spectrophotometer, DNA, Quantification
핵산을 다루는 실험에서 그 효율성은 시료에서의 핵산의 농도와 순도에 의해 결정된다. 핵산의 정량에 있어서 DNA는 UV의 분석으로 쉽게 측정 할 수 있으며 순도에 대한 정보도 알 수 있다.
핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 등은 퓨린 및 피리미딘 염기의 공명구조 때문에 260 nm에서의 자외선을 강하게 흡수한다. 개개의 염기들은 각기 특성적인 자외선 흡수 스펙트럼을 가지며, 핵산의 총 흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총 흡광도의 합과 같다고 생각할 수 있기 때문에 260 nm 에서의 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 산출한다. 핵산을 정량하거나 순도를 확인하기 위해서는 기본적으로 자외선-가시광선 분광광도계 (UV-Vis spectrophotometer)를 이용한다.
농도의 측정을 위해 사용할 수 있는 DNA 나 RNA 와 같은 핵산시료는 매우 소량으로, 부피가 큰 표준 cell 을 사용하면 시료의 소모가 많다. 또한 농도가 진한 핵산의 경우 샘플을 희석해서 사용해야 하는 번거로움이 있어 최근에는 수 마이크로리터의 샘플로 측정이 가능한 분광광도계나 큐벳이 개발되고 있다. 그러나 현재 나와 있는 분광광도계나 큐벳의 경우에는 고가의 제품들이 일반적이다. 또한 세척이 불편하거나 데이터의 재현성이 좋지 않는 등의 단점이 있다.
신코에서는 이런 단점을 보완한 Bio 전용 cuvette인 Nano Stick을 출시하였다. Nano Stick은 미량의 핵산, 단백질 샘플 측정에 최적화된 cuvette으로 0.5 mm, 0.2 mm pathlength 선택이 가능하며, 최소 1 ul를 사용하여 고농도의 샘플을 희석없이 측정할 수 있다. 또한 10 x 10 mm standard cuvette과 같은 사이즈로 기존의 모든 UV-Vis spectrophotometer에도 사용이 가능하고 샘플링 및 세척이 용이하다.
이번 실험에서는 Nano Stick을 이용하여 최소 1 ng/ul에서 고농도까지의 DNA 정량 실험을 수행하였다.
Nano Stick은 Micro volume cuvette으로 자성이 있는 두 개의 plate로 구성되어 있다 (Figure 1). 두 개의 plate를 합치면 일반적인 standard cuvette과 같은 사이즈가 되어 사용자가 보유하고 있는 기존의 UV-Vis spectrophotometer의 cell holder에서 사용 가능하다.
Nano Stick의 샘플 window 부분이 빛이 통과하여 샘플의 흡광도를 측정하는 방식이다 (Figure 2).
• DNA sodium salt from Salmon Testes(Sigma D-1626)
• TE buffer (10 mM Tris HCl, 1mM EDTA pH 8.0)
• S-3100 PDA UV-Vis Spectrophotometer
• LabPro® Plus Software
• Nano Stick (0.5 mm, 0.2 mm pathlength)
1. DNA (Sigma D-1626)를 10 mM TE buffer에 녹인 후 단계 희석하여 샘플을 준비한다.
2. Nano Stick에 샘플링 후 S-3100 UV-Vis spectro- photometer에서 각 농도별로 5회씩 반복 측정한다.
3. 0.5 mm pathlength Nano Stick과 0.2 mm pathlength Nano Stick을 같은 방법으로 측정하여 각각의 정량 가능한 농도 범위를 확인한다.
1. 0.5 mm pathlength Nano Stick
Figure 3에는 0.5 mm pathlength Nano Stick을 이용한 DNA의 검정곡선 결과를 보여준다. 검정 곡선은 2000 ng/ul의 DNA를 단계 희석하여 희석 배수에 대해 측정된 DNA 농도 값으로 나타내었다.
Figure 3. 0.5 mm Nano Stick 사용 시 검량 곡선
2. 0.2 mm pathlength Nano Stick
Figure 4에는 0.2 mm pathlength Nano Stick을 이용한 DNA의 검정곡선 결과를 보여준다. 검정 곡선은 5000 ng/ul의 DNA를 단계 희석하여 희석 배수에 대해 측정된 DNA 농도 값으로 나타내었다.
Figure 4. 0.2 mm Nano Stick 사용 시 검량 곡선
Table. 1에는 각 pathlength 별 Nano Stick을 사용 시 측정한 DNA 농도 범위와 검량곡선의 R2값을 나타내었다. 두 Nano Stick 모두 R2값이 1에 가까운 직선성을 보임을 확인할 수 있었다.
Pathlength |
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0.2 mm |
R2 |
0.9999 |
0.9997 |
측정 농도 범위
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1 ~ 2000 ng/ul |
1 ~ 5000 ng/ul |
㈜신코의 Nano Stick과 S-3100 PDA Spectrophoto-
meter를 이용하여 DNA의 정량 직선성을 확인하였다. 0.5 mm pathlength , 0.2 mm pathlength Nano Stick 모두 R2 값이 1에 가까운 직선성을 나타냄을 검량 곡선을 통해 확인하였다. ㈜신코의 Nano Stick을 이용하여 최소 1 ul의 소량의 시료로 1 ng/ul에서 고농도의 DNA까지 희석없이 측정할 수 있다.
1.Maniatis, F.L., Firitsch, E.F., Sambrook, J.,Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982.
2. Robert E. Farrell, Jr., RNA Methodologies :Academic Press, 1993.
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