지구 생물의 원동력인 단백질은 매우 복잡 한 구조로 배열되어 있으므로 쉽게 변형이 되지 않는다. 현대 의학에서는 단백질의 형태나 기능의 이해를 통하여 우리에게 필요한 약물 개발을 하고 있다. 그 중 한 예로 요즘 가장 주목 받고 있는 HIV-1의 구조를 들 수 있는데 그 복잡한 구조는 아래에서 확인 할 수 있다. 복제 후에 단백질은 바이러스의 필요에 의해 서로 비활성으로 묶여 있는데 단백질 분해 효소가 고정 끈을 잘라 단백질을 활성화 시키는 역할을 한다. 이와 같은 역할을 하는 효소를 찾아 내는 것이 에이즈 치료의 초석이라고 할 수 있다.
이런 단백질의 이차 구조 분석을 위해 FT-IR이 사용되고 있으며 특히 아래와 같은 특징을 가지는 Proteus kit이 함께 제공되어 보다 편리하고 정확한 데이터를 얻을 수 있다.
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고감도 샘플 투과 방식이다. *최근에는 ATR을 이용한 방식도 제공되고 있다. |
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TE (Thermoelectrocally) 승온 / 냉각 방식 투과 셀로 구성되어 있다. |
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소프트웨어로 조절이 가능한 온도 조절기가 있다. |
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단백질 분석에 도움을 줄 가이드북이 제공된다. 물의 존재는 단백질 적외선 스펙트럼의 데이터를 얻는데 큰 걸림돌인데 가이드북에서는 양질의 스펙트럼을 얻을 수 있는 SOP(Standard Operating Procedures)를 제공 한다. |
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Proteus kits는 QA/QC 분석에 매우 가치 있는 도구가 될 것이다. |
이 글에서는 BSA를 통하여 단백질의 온도 변성에 대하여 설명을 할 것이다. BSA(Bovine Serum Albumin)는 혈액의 불용성 물질을 수송하는 단백질인데 실험실에서 일반적으로 취급되는 단백질이다. 일반적으로 단백질은 극한의 온도 변화, 높은 염도, 광노출 및 환경 변화에 따라 변성이 되는데 BSA가 온도 변화에 따라 어떻게 변성이 되는지 (BSA의 2차 구조의 변화) Proteus kit TE-controlled accessory와 OMNIC을 사용하여 알아보도록 하겠다.
Proteus kit transmission accessory는 아래 사진과 같이 Research grade 장비인 Nicolet 6700장비에 장착 할 수 있다. (최근에는 Nicolet 6700장비의 후속 모델인 Nicolet iS50에 장착 한다.) 적외선 분광기는 IR source, KBr beam splitter와 TE-DTGS 검출기로 구성이 되며 전체 시스템은 실험하기 몇 시간 전부터 Dry air로 Purge를 하였다.
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CaF2 IR 윈도우 사이에 6 micron spacer를 넣는다. Spectra-Tech sealed liquid transmission 셀을 사용하였다. |
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작은 구멍 주사기로 셀을 채운다. 셀은 토크렌치를 사용하여 Sealed되었다. |
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1.5mL의 Phosphate 버퍼 (pH = 7.2, EDTA)안에 14.7mg의 BSA를 녹인 후, 9.8 mg/mL 의 용액을 만들었다. 샘플은 영하 10도로 보관하였다. |
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OMNIC과 함께 @Temp controller interface 프로그램을 사용하여 온도 조절 단계와 안정화 시간 간격 및 데이터 수집에 관한 설정을 한다. |
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처음에는 6도에서 62도 까지 8도 간격으로 데이터를 수집하고, 두 번째에는 5도에서 80도 까지 15도 간격으로 데이터를 수집한다. (256 scans at 4 cm-1 resolution) |
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OM한다. |
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데이터를 얻을 때마다 5분간의 안정화 간격을 두고 온도와 Purge가 안정화 되게 한다. |
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OMNIC’s Peak Resolve를 이용하여 자동으로 단백질을 넣은 버퍼에서 버퍼를 뺀 데이터를 얻는다. |
Amide I Band는 1600 cm-1 에서 1700 cm-1 사이에서 나오며 Amide II Band는 바로 아래의 범위에서 나오게 되는데 Amide II가 Amide I과 겹쳐지면서 분석에 방해를 하게 된다. 하지만 이는 Peak resolve로 Peak의 위치, 넓이, 영역 등의 정보를 알 수 있다. 이로써 단백질 구조의 변화를 감지 할 수 있게 된다. 아래 표에서 확인 할 수 있듯이 낮은 온도와 높은 온도에서 분명한 차이를 볼 수 있다.
아래 표에서도 분명하게 확인 할 수 있듯이 온도가 높아짐에 따라 Alpha-helix의 신호가 낮아지는 것을 확인 할 수 있다.
Thermo Electron Corporation’s Proteus analysis kit는 단백질 분석에 있어 빠르고 정확한 도구임이 분명하다. 이 장비는 유저가 원하는 방식에 대하여 유연하게 대응이 가능하며 온도 조절이 간단하게 제공되며 좋은 데이터 수집이 가능하다.
Thermo Electron Application Note 50733 “Curve ?tting in Raman and IR Spectroscopy: Basic theory of line shapes and applications” by Michael S. Bradley.
www.rcsb.org, PDB reference 9HVP: Erickson, J., Neidhart, D. J., Vandrie,J., Kempf, D. J., Wang, X. C., Norbeck, D. W., Plattner, J. J., Rittenhouse, J. W., Turon, M., Wideburg, N., Kohlbrenner, W. E., Simmer, R., Helfrich, R., Paul, D. A., Knigge, M. “Design, Activity and 2.8 Angstroms Crystal Structure of a C2 Symmetric Inhibitor Complexed to HIV-1 Protease” Science 249 pp. 527 (1990).
Jackson, M., Mantsch, H. H. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 1995, 30(2), pp. 95-120.
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