Sample Preparation: 두 세트의 샘플들은(Acetonitrile과 사과주스) 10ml의 Acetonitrile과 사과주스에 각 10ppm의 독성시료를 첨가해서 준비했다. Acetonitrile에 첨가한 독성시료는 Colchicine, Strychnine 과 Aconitine이고, Lobeline과 Solanine은 사과주스에 첨가했다. 이 혼합물은 30분간 흔들고 분석 전까지 4℃에서 보관시켰다. 용매와 매트릭스 Blank는 어떠한 성분의 첨가 없이 같은 방법으로 준비했다. 샘플은 Ultra High Pressure Liquid Chromatography Mass Spectrometry (UHPLC-MS)인 Thermo Scientific Accela 1250 pump와 Q Exactive™ Benchtop Mass Spectrometer로 Full Scan과 Data Dependent MS/MS로 6.5분 Gradient 조건에서 분석했다. 첨가된 성분의 확인은 분석을 위해 사전에 분석자에게 알려주지 않았기에 첨가된 성분은 분석자에게 “미지시료”가 되었다.

Liquid Chromatography:

Mass Spectrometry:

FIGURE 1. Q Exactive Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer

Data Analysis: 데이터 획득은 Thermo Scientific Xcalibur 2.1 소프트웨어로 실행했다. Thermo Scientific SIEVE 1.3 소프트웨어의 Differential Analysis은 첨가한 샘플과 컨트롤 샘플을 Principal Component Analysis(PCA)으로 분석했다.

Figure 2은 미지시료 스크리닝을 위한 전체적인 SIEVE Workflow를 보여준다. 간단히 살펴보면, 첫 번째로 획득된 LC 크로마토그램들은 LC Runs로부터 얻어지는 불규칙적인 Retention Time을 선택한 기준 Raw 파일을 바탕으로 정렬(Chromatogram Alignment)한다. 그런 다음 모든 Peaks는 주어진 Intensity Threshold 보다 높은 경우 Intensity를 바탕으로 정렬된다. 0.30 min x 0.010 amu (Figure 3)의 Frames은 가장 Intense한 것에서부터 두 번째로 높은 피크까지 이 전의 Frames와 중복되는 것 없이 정렬된다. 9분 Gradient안에 분류된 2,700,000 Frames은 PCA 분석에 의해 샘플에 존재하는 분석물질을 정의하는데 사용되었다. Differential Analysis으로부터 발견된 이온들은 ChemSpider™ 온라인 데이터베이스 탐색을 통해 자동으로 인지하고 MS/MS Spectra로 확인했다.

FIGURE 2. SIEVE Workflow

FIGURE 3. Frame Parameters