1) Structural Identification and Confirmation
그림 2.는 Extracted Ion Chromatograms과 0.5μg/L농도의 MC(Microcystin) -RR, MC (Microcystin) -YR, MC (Microcystin) -LR을 포함하고 있는 혼합물의 Full-scan LC-MS/MS 분석에서 얻어진 MS/MS스펙트라이다. MC (Microcystin) -RR, MC (Microcystin) -YR, MC (Microcystin) -LR은 5.6분, 6.85분 그리고 6.93 분에서 각각 분리되어 나타난다. MC (Microcystin) -RR의 MS/MS 스펙트럼은 [M+2H]²⁺이온을 CID(Collision Induced Dissociation)하여 만들어진 것이며 주요 Fragment 이온은 m/z 505, 452 그리고 887으로 각각 [M+2H-CO]²⁺, [M+2H-C₉H₁₀O]²⁺ 그리고 [M+H-C₉H₁₀O-NH₃]⁺이온이다. (C₉H₁₀O은 Adda 잔기의 Fragment이다.) 가깝게 분리되어 나오는 MC-YR과 MC-LR도 획득한 MS/MS스펙트라에서 쉽게 구별된다. [M+H]⁺이온을 CID하여 만들어진 MC-YR MS/MS스펙트럼은 주요 Fragment 이온 m/z 1017, 599 그리고 916을 포함하고 있으며 각각 [M+H-CO]⁺, [Arg+Adda+Glu+H]+, 그리고 [Arg+Adda+Glu+Mdha+Ala+Tyr+H]⁺이다.
MC- LR의 [M+H]+이온에 대한 CID MS/MS 스펙트럼의 주요 Fragment 이온은 m/z 967([M+H-CO]⁺ ), m/z 599([Arg+Adda+(Glu or MeAsp)+H]⁺), m/z 866 ([Ala+Adda+Arg+(Glu or MeAsp)+Leu+Mdha+H]⁺), m/z 553([Ala+Arg+(Glu or MeAsp)+Leu+Mdha+H]⁺)로 특징지어진다.

그림 2. Extracted ion chromatograms and MS/MS spectra for MC-RR, MC-YR and MC-LR at concentrations of 0.5 μg/L

2) Quantitative Analysis
정량분석에 대한 최상의 신뢰성을 보장할 수 있도록 LTQ Velos Pro MS는 빠른 스캔 스피드와 분석 사이클 타임이 크로마토그래프 피크 하나에 더 많은 수의 스캔을 가능하게 한다.(그림 3)

그림 3. High scan speeds and fast cycle times enable more than 20 data points to be acquired across the MC-LR chromatographic peak

그림 4와 같이 Heating Block과 Precision Cell은 열손실에 의한 온도차이가 다소 존재하지만, 그 차이 정도가 선형적이기 때문에 데이터간의 상관관계를 확인할 수 있었다.
이후 실험에서 시료의 온도는 적외선 온도계를 사용하여 측정한 값을 기준으로 표시하였다.

다음으로 온도에 따른 형광 세기 변화를 확인해 보았다. 그림 5 (a)와 같이 온도가 상승하며 형광 방출 (Emission) 세기가 감소하는 온도 소광 현상을 확인 할 수 있다. 또한 그림 5 (b)와 같이 형광 들뜸 (Excitation) 스펙트럼에서도 온도 상승에 따라 형광 세기가 감소함을 볼 수 있었다.

그림 4. Calibration curves for quantitation of MC-RR,
MC-YR and MC-LR

세 가지 모든 마이크로시스틴(Microcystin)에 대하여 0.05-50 μg/L이상의 범위에서 뛰어난 직진성(Linearity)을 보인다. 그림 4.는 MC-RR, MC-YR 그리고 MC-LR에 대한 검량곡선이며 각각 0.9986, 0.9994 그리고 0.9994의 직진성을 보인다. 각각의 마이크로시스틴 (Microcystin)에 대한 LOD(Lowest Detectable Amount)는 0.025 μg/L이며 LOQ(Lowest Quantifiable Amount)는 0.05 μg/L이다. 두 가지 0.5와 5 μg/L 농도의 QC샘플은 정량 정확도가 모든 마이크로시스틴 (Microcystin)에 대하여 94%이상을 보였다. Thermo Scientific사의 Xcalibur 소프트웨어의 자동화된 ICIS 통합 알고리즘에서 MC-LR가 LOQ일 때 얻어진 S/N의 비율이 25이상 이다.(그림 5) 이것은 WHO에서 제안한 가이드라인 농도인 1 μg/L보다 낮은 농도에서도 위 실험과 같은 LC-MS/MS방법이 활용될 수 있다는 것을 증명한다.

그림 5. For MC-LR at the LOQ (0.05 μg/L),
S/N > 25 and peak area RSD = 6.91%

각 분석물질들에 대하여 5번 반복 실험하여 이 방법에 대한 재현성을 평가하였다.
MC-LR와 MC-YR에 대한 피크 면적 RSDs는 전체 Linear Dynamic Range을 넘어서도 각각 7% 와 11% 이하이다.(표 2) MC-RR은 피크 면적 RSDs가 0.10-50 μg/L 이상의 범위에서 6%이하였으며 LOQ일 때, 피크 면적 RSDs는 16%였다.(표 2)

표 2. Peak area precision (from five replicate injections)
for LC-MS/MS assay of MC-RR, MC-YR and MC-LR

세 가지 모든 마이크로시스틴(Microcystin)에 대하여 Retention time의 정확도는 전체 Dynamic Range을 넘어서는 범위에서 0.3% RSD이거나 작다.(그림 6) 수돗물, 정수된 물 그리고 연못물의 표면을 이 방법으로 분석하였으며 이 세 가지 식수원 어디에도 마이크로시스틴(Microcystin)은 없었다.

그림 6. High retention-time precision (< 0.3% RSD) over a wide linear dynamic range

마이크로시스틴(Microcystin)의 정량실험을 위한 간단하고, 예리하며 신뢰성있는 LC-MS방법이 개발되었다. LTQ Velos Pro Linear Ion Trap MS를 이용한 Targeted Full-Scan MS/MS 분석은 넓은 Linear Dynamic Range에서 MC-RR, MC-YR 그리고 MC-LR를 확인하고 정량실험을 할 때 가장 뛰어난 선택성과 감도를 제공하였다. LOD와 LOQ는 각각 0.025 μg/L과 0.05 μg/L이었다.
LOQ는 WHO가 임시적으로 발표한 식수에서의 MC-LR 농도 가이드라인 레벨보다 상당히 낮았다. Full-Scan MS/MS 모드로 수행된 분석은 Compound-Dependent 파라미터의 최적화 없이도 화합물을 정성/정량분석할 수 있다. 이 방법은 수돗물, 정수된 물 그리고 연못물의 표면을 분석할 때도 사용되었으며 이 세 가지 식수원 어디에도 마이크로시스틴(Microcystin)은 없었다.

1. Toxic cyanobacteria in water: A guide to their public health consequences, monitoring and management; Chorus I, Bartram J, eds. Published by E & FN Spon, London, on behalf of the World Health Organization, Geneva. 1999
2. Ingested Nitrate and Nitrite and Cyanobacterial Peptide Toxins. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum, 2010, 94:1-477.
3. WHO Guidelines for Drinking-water Quality, 3rd Ed., Vol. 1, Recommendations; WHO, Geneva. 2004
4. ISO Water Quality: Determination of microcystins -method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection. ISO, Geneva, Switzerland (ISO 20179:2005).