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일반적으로 식물성플랑크톤이라고 불리는 시아노박테리아는 광합성 원핵생물로서 물의 표면에서 자연적으로 발생한다. 그들은 1차 생성물과 영양계에 상당한 기여를 한다. 부영양화가 나타나는 따뜻하고 변화가 거의 없는 깨끗한 환경의 물에서는 일반적으로 식물성플랑크톤 군집 중 시아노박테리아의 번식이 두드러진다. 시아노박테리아의 급격한 확산은 생태계를 방해하여 물의 냄새와 맛에 나쁜 영향을 주며 물을 정화하는 비용을 증가시킨다. 식수원이나 휴양지 바다의 표면에서 나타나는 독성 시아노박테리아는 사람들의 건강을 위협한다. 신장 투석 후에 나타나는 위장병, 피부 염증, 사망 등은 급성 시아노박테리아 독성에 노출된 결과로 본다. 만성적인 노출은 간 손상에 원인이 될 수 있으며 1차성 간암과 관련될 수 있다. 시아노박테리아 대량증식 발생 빈도가 전세계적으로 증가하고 있어 시아노박테리아 독성 관찰의 중요성이 강조되고 있다.
흔히 접하게 되는 시아노박테리아의 독성물질들은 마이크로시스틴(Microcystin), 다양한 시아노박테리아 속(Genera)에서 생성되는 간 독성 싸이클릭 펩타펩티드(Hepatotoxic Cyclic Heptapeptide) 그룹, 마이크로시스티스(Microcystis), 플랭크토트릭스(Planktothrix), 아나베나(Anabaena) 등이다.
그림 1. The chemical structure of MC-LR contains leucine (L) and
arginine (R) at positions X and Y,
respectively. Microcystin nomenclature is based on the L-amino acids present at these two positions
이러한 독성 물질들과 N-methyl dehydroalanine(Mdha)의 생물학적 활동을 조절하는 마이크로시스틴(Microcystin)의 화학적 구조는 그림 1.에 묘사되어 있는 amino acid 3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyl-deca-4,6-dienoic acid (Adda)이다. 마이크로시스틴(Microcystin)의 명명법은 분자에서 L-amino acids가 존재하는 두 위치(X and Y in 그림 1.)에 기반을 둔다. 80개 이상의 구조적 변종이 알려져 있으며, 사슬의 변형뿐만 아니라 두 개의 가변적인 L-amino acids에 의해 차이를 보인다. Serine(S)/Threonine(T) 단백질 포스파타아제(Protein Phosphatase) 타입 1과 2A를 억제하는 것은 마이크로시스틴(Microcystin) 독성의 주요 메커니즘으로 생각되고 있다. 가장 널리 퍼져있고 독성있는 마이크로시스틴(Microcystin)의 하나인 마이크로시스틴(Microcystin) -LR은 국제 암연구기관(IARC)에서 인간에게 암을 유발할 수 있는 물질로 지정되었다. 식수에 있는 마이크로시스틴(Microcystin)의 만성적인 노출에 대한 잠재적인 위험 때문에 세계보건기구(WHO)는 식수로 가능한 마이크로시스틴(Microcystin)-LR의 최대 농도가 1 μg/L라고 임시적인 가이드라인을 발표하였다. 많은 국가와 지방정부는 이 가이드라인 수치를 바로 채택하거나 조금 수정하여 시행하고 있다.
독성 시아노박테리아 군집은 항상 다양한 농도로 수많은 동일 마이크로시스틴(Microcystin)속 (Congener)의 생물들이 모여 구성된다. 마이크로시스틴(Microcystin)을 분석하기 위한 수 많은 기술들이 개발되어 왔고, 쥐를 이용한 생물학적 정량(Mouse bioassays)이나 단백질 포스파타아제 (Protein Phosphatase), 그리고 간접효소면역측정법(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) 등이 빠른 스크리닝을 위해 효과적이지만 특이성이 부족하다. UV로 검출하는 역상 크로마토그래피 방법은 마이크로시스틴(Microcystin)을 분리, 검출 그리고 정량실험을 하는 데 가장 흔한 접근 방법이다. HPLC-UV을 이용한 마이크로시스틴(Microcystin)분석을 위한 ISO방법은 MC (Microcystin) -RR, MC (Microcystin) -YR 그리고 MC (Microcystin) -LR에 대하여 인증받았다.
그러나, UV검출은 물 매트릭스의 표면에서는 시그널이 약하며 정제된 샘플이 필요하고 또한 검출 한계가 있기 때문에 샘플의 농축이 요구된다. 더불어, UV를 기본으로 한 방법들은 알려진 마이크로시스틴 (Microcystin)을 정확하게 분석하지 못하고, 예상치 못한 변종이나 이형들에 관하여서도 정확한 확인이 불가능하다. 다중텐덤 질량분석기(LC-MSn)와 조화를 이룬 액체 크로마토그래프는 극미량의 마이크로시스틴(Microcystin)에 대해서도 분명한 분석 및 구조 확인이 가능하다. MRM(multiple reaction monitoring)모드에서 LC-MS/MS는 매우 선택적이고 예리하게 목적하는 마이크로시스틴(Microcystin)의 정량 및 확인을 가능하게 해주지만, 이 접근법은 많은 양의 Compound-Dependent 파라미터를 최적화해야 하며 예상치 못한 독성물들을 확인하는 데는 사용될 수 없다. Full-scan MS/MS 방법은 이러한 Compound 최적화의 필요성을 요구하지 않으며 샘플에 존재하는 모든 마이크로시스틴(Microcystin)을 측정할 수 있다.
본 연구는, Thermo Scientific사의 Velos Pro Dual-Pressure Linear Ion Trap MS는 감도와 스캔 스피드가 뛰어나 정성분석과 정량분석에 대한 결과를 동시에 얻을 수 있다. 빠른 스캔 사이클 타임은 크로마토그래프 피크 당 더 많은 스캔이 이루어질 수 있게 하며 더 짧은 크로마토그래프에서 더 많은 MSn 스펙트라를 얻을 수 있게 한다. Velos Pro MS의 6 Orders의 넓은 Dynamic Range은 복잡한 매트릭스에서 적은 양의 화합물을 확인하고 정량하는 것을 가능하게 한다. 하나의 샘플로부터 더 많은 MSn 정보를 얻을 수 있도록 상호보완적인 Fragmentation기술(PQD, CID, TrapHCD)들이 동시에 수행될 수 있다. 이 실험에서, 우리는 Thermo Scientific Dionex사의 UltiMate 3000 x2 Dual RSLC system과 함께 Velos Pro Dual-Pressure Linear Ion Trap MS를 사용하여 MC (Microcystin) -RR, MC (Microcystin) -YR 그리고 MC (Microcystin) -LR을 정량하고 확인하였다.
1) Sample Preparation
MC (Microcystin) -RR, MC (Microcystin) -YR 그리고 MC (Microcystin) -LR의 표준물질을 준비한다. 이렇게 세 가지 마이크로시스틴(Microcystin) 혼합물을 5μg/ml의 농도로 준비한다. 샘플을 가지고 순차적으로 희석한 0.025 μg/L에서 50 μg/L 농도의 Calibration 용액을 준비한다.
2) LC-MS/MS Analysis
Thermo Scientific사의 Acclaim 120 guard cartridge에 150 L/min속도로 50 μL의 샘플을 주입하고, 염을 제거하기 위해 2분 동안 세척한 뒤, Thermo Scientific사의 PepMap100 analytical column으로 분리한다. LC-MS/MS 분석은 Velos Pro MS와 UltiMate™ 3000 x2 Dual RSLC system로 수행된다.
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