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Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (monosodium salt), D-glucose-6-phosphate, glucose-6-phosphate dehydrogenase, ethylenediaminetetraacetic acid (disodium salt, 0.5 M) [EDTA], magnesium chloride (1.0 M) [MgCl2], glutathione 와 nefazodone 은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. |
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1) |
모든 Human Liver Microsomal(1ml)은 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mg/mL Microsomes, 10 μM Nefazodone, 5 mM Glutathione 과 1 mM NADPH에서 배양한다. |
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2) |
모든 시료는 시약을 제외한 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.4)에 1 mM Acetonitrile:H2O (1:1)10 μL으로 최종 0.1% 미만이 되게 Acetonitrile을 준비한다. |
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3) |
Tube를 연 상태에서 37 °C 로 한 시간 정도 배양하고, 최종 Ice-Cold Acetonitrile 3 mL를 첨가하고 Tube를 Vortex한 뒤 5 °C에서 10분동안 1,203 g 으로 Centrifugation 한다. |
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4) |
상등액은 깨끗한 Tube로 옮긴 뒤, 상온에서 질소 가스로 말린다. |
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5) |
나머지는 Water:Acetonitrile (9:1) 200 μL으로 녹여서 Hand-Vortex한 뒤 0.45 μm Nylon Filter를 이용하여 상온에서 10분 동안 7,200 g 으로 Centrifugation한다. |
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6) |
여과액은 하기 방법을 이용하여 LC/MS와 MS/MS로 분석한다. |
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Coulmn : Thermo HyPURITY AquastarTM Column (100 x 2.1 mm ID, 3 μm) |
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HPLC : |
Surveyor Plus HPLC System
- Flow Rate: 400 μL/min, Injection Volume: 20 μL
- Mobile Phase: A-Water with 0.2% Formic Acid,
B-Acetonitrile with 0.2% Formic Acid |
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MS : LTQ Orbitrap |
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1. |
LC에 의해서 분리된 시료는 시간에 따라 On-line으로 연결된 LTQ Orbitrap으로 분해능 (R=60,000)에서 Full Scan MS 를 한다. |
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2. |
순차적으로 앞서 Full Scan한 Spectrum에서 Cl의 동위원소를 포함한 Intensity가 가장 큰 Compound를 자동으로 검색하여 Full MS/MS 한다. |
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3. |
앞서 Full MS/MS 한 Spectrum에서 가장 Intensity가 큰 Compound를 분해능 (R=30,000)에서 MS3를 한다. |
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4. |
잇따라 Full MS3 한 Spectrum에서 가장 Intensity가 큰 Compound를 분해능 (R=30,000)에서 MS4를 한다. 상기 과정은 Figure 1과 같은 Method로 설정하면 모두 자동 실행되어 데이터들이 얻어진다. |
[Figure 1 : Schematic of LTQ Orbitrap method setup using lsotopic Data
Dependence to trigger MSN on compounds containing a chlorine isotope pattem] |
