Fluorescence spectrometer, Rapid mixing accessory, stopped-flow photometer, reaction rate, dead time

Rapid mix accessory는 빠른 시간에 반응을 하는 시료의 반응 속도에 관한 정보를 얻을 수 있는 유용한 도구이다. Rapid mix accessory의 성능에 가장 큰 영향을 미치는 인자는 “Dead time”이다. Dead time이란 반응이 시작되는 시점(샘플이 섞이는 순간의 시간)과 첫 관측이 시작되는 시점의 시간 차이를 의미한다. Dead time 작을수록 빠른 속도로 일어나는 반응을 측정할 수 있기 때문에 dead time은 Rapid mix accessory의 성능을 결정짓는 중요한 인자이다.

본 실험에서는 Rapid mix accessory를 이용하여 dead time을 측정하기 위해서 형광물질인 N-acetyltryptophanamide (NATA)와 1:1로 반응하는 것으로 알려져 있는 형광억제물질(Quencher)인 N-bromosuccinimide (NBS)를 반응시켜 형광 소멸 곡선을 측정하였다. NATA와 NBS의 형광 소멸 곡선은 간단한 Single-exponential decay를 한다고 알려져 있기 때문에, 이 곡선을 single-exponential decay curve fitting하면 속도상수(k)와 형광 소멸 시간(t)을 구할 수 있다. 구해진 수식에 NBS와 반응하기 전의 순수한 NATA의 형광 세기를 대입해서 다시 fitting하면 Rapid mix accessory의 dead time을 구할 수 있다. 모든 시료는 0.1 M Sodium phosphate를 용매로 사용하였고 pH는 7.5로 조절 하였다.

본 실험에서 사용한 Rapid mixing accessory는 Applied Photophysics사의 RX.2000 Rapid Mixing Stopped-Flow Unit이며 이 장치를 FS-2에 장착하여 Time-scan mode에서 반응속도와 dead time을 측정하였다.

1. Rapid mixing accessory (AppliedPhotophysics)

[그림 1. Rapid mixing accessory (AppliedPhotophysics)]

2. 5 uM N-acetyltryptophanamide (NATA)

[그림 2. N-acetyltryptophanamide (NATA) (좌)와
N-bromosuccinimide (NBS)(우)의 분자구조]

3. 50 uM N-bromosuccinimide (NBS)
4. 0.1 M Sodium phosphate (pH 7.5)