3.5 mL 용량의 Macro-cell을 이용한 Wave-scan mode에서 형광 측정 결과 NATA의 maximum excitation 파장은 약 390 nm, maximum emission 파장은 약 460 nm에서 나오는 것을 확인할 수 있었다. (그림 5)

[그림5. NATA의 들뜸 및 형광 스펙트럼]

Time-scan mode에서 각각의 형광 및 들뜸 최대 파장을 그림 4와 같이 입력한 후 Start 버튼을 누르면 형광 측정 대기 상태로 들어간다. Procedure에 설명된 순서대로 실험을 하면 그림 6과 같은 NATA의 초기 형광 세기와 형광 소멸 시간 그래프를 얻을 수 있다.

[그림6. NATA의 초기 형광 세기(적색), NBS와 반응 후의 형광 소멸 곡선(검은색),
Single exponential decay curve fitting 결과 (파란색)]

Single-exponential decay fitting에는 위의 식을 사용하였다. 위 식에서 y₀는 빛이 없을 때의 형광 세기 값을 나타내며, x₀는 발광 검출 시작 시각, A는 x 시각에서의 발광 세기, t₁ 는 발광의 소멸 시간을 나타낸다. 속도상수(k)는 발광 소멸 시간 t₁ 의 역수이다.

x₀는 발광 검출 시작 시각, 즉 0 s로 설정하고, 이때의 intensity 27000 을 A 값으로 설정한 후 single exponential decay fitting을 수행하면 decay time (t₁)은 33.66 ms, 반응 속도 상수는 29.7 s^-1, 로 계산된다.

이 결과에서 dead time을 구하기 위해서 A값을 순수한 NATA의 형광 세기 값인 약 45000으로 설정하고decay time (t₁)은 33.66 ms를 대입 후 x₀값만을 변수로 놓고 single exponential decay fitting을 수행하면 약 -16 ms의 x₀ 값을 얻을 수 있으며 이 값, 즉 16 ms이 dead time이 된다.

본 실험에서는 ㈜신코의 형광 분광광도계 FS-2와 Rapid mix accessory를 이용해서 반응 속도 상수와 기기의 dead time 구하는 방법을 알아보았다. Rapid mix accessory를 이용해서 NATA와 NBS를 매우 빠르게 섞을 수 있었고, 두 물질이 반응하는 동안에 형광 소멸 곡선을 구할 수 있었다. 형광 소멸 곡선을 single-exponential decay fitting을 통해서 29.7 s^-1 의 속도상수와 16 ms의 dead time을 구할 수 있었다.

1. Richard A. Harvey., Anal. Biochem. 29, 58 (1969)
2. B. F. Peterman., Anal. Biochem. 93, 442 (1979)