LTQ Orbitrap을 이용하여 Figure 1B에서 보는 바와 같이, 고감도 질량분석기로 익히 알려진 LTQ Ion Trap과 2ppm의 고정확성을 가지는 Orbitrap으로 각각 Data Dependent MS/MS을 이용하여 Parallel 모드로 데이터를 얻었다. Parallel 모드는 유일하게 Thermo Hybrid 장비에서만 Cycle Time의 증가 없이 Data Dependent Ion Trap MS/MS와 Data Dependent HCD MS/MS를 제공한다. CID와 HCD의 MS/MS는 단백질 서열을 밝히는데 이용함과 동시에 HCD 데이터는 iTRAQ Reporter Ion에 대한 정확한 분자량 Fragments와 iTRAQ Reporter Ion의 양적 정보를 제공한다. iTRAQ을 Tagging한 Peptide 혼합물의 일반적인 시료 분석을 위해, 어미이온의 Isolation Width를 2amu, MS/MS Target Value를 105으로 최적화했다. 아울러, 농도에 있어 넓은 Dynamic Range를 가지면서 더 복잡한 샘플에 대해서는 MS/MS Target Value를 2x10⁵으로 사용하면 보다 탁월한 HCD 데이터를 얻을 수 있다. 이 경우에 “C-trap Multiple Fill”이라 옵션을 사용하여 LTQ Developers Kit에서 2amu Isolation Width를 설정하면 좋은 결과를 얻을 수 있다.

HCD 실험에서 Collision Energy는 어미이온의 m/z와 Charge State에 따라 자동으로 표준화되어 설정된다. 최적화된 HCD Fragmentation 조건을 결정하기 위해 30%, 35%, 40%의 Normalized Collision Energy(NCE)를 수행 후 비교했다. 일반적으로 Peptide를 40%의 NCE로 Fragmentation시켰을 때, iTRAQ Reporter Ions이 뚜렷하게 검출됨과 동시에 구조적으로 관계된 Fragment Ions이 검출되었다. (Figure 2) 이 세가지 NCE에 따른 단백질 서열과 단백질 정량 결과는 Figure 3A, 3B에서 제시하는 바와 같다. 9개의 혼합 단백질에 대한 결과는 세가지 NCE에서 각각 HCD Scans을 수행하여 모두 확인하였다. 아울러, 데이터로 제출하지는 않았지만, NCE를 45%로도 시도해 보았으나, 오히려 단백질 서열 및 정량면에서 감소하는 현상을 보였다. 따라서 NCE가 40%일 때, 최적화된 단백질 서열 확인 및 정량분석에 가장 적합한 것으로 확인하였다.

정밀도와 정확도는 정량분석에 있어 매우 중요한 측정기준이 된다. iTRAQ을 붙인 단백질의 정량분석은 MS/MS 데이터에서 iTRAQ Reporter Ion의 Intensity에 근거를 둔다. FT MS를 이용할 때, 스펙트럼들의 S/N 비는 Fourier Transformation 수행 전에 Micro-Scans수를 평균한 것에 Square Root한 것이 비례하기에 Micro-Scans을 더 평균화 시킬수록 S/N 비가 개선된다. 높은 S/N비는 Ion 통계치를 개선시킴으로써 정량적인 정확도 및 정밀도를 제공한다. 하지만 최적의 데이터를 얻기 위해서는 Cycle Time이 증가되어야 한다. 본 연구에서는, 단백질 획득과 Peptide 정량에 정밀도와 정확도를 평가하는데 있어서 HCD를 이용할 때, Micro-Scans 수 증가에 따른 효과에 대해서도 연구했다. 그 결과, iTRAQ 실험에서 정량성의 높은 정확도와 정밀도 둘 다 HCD MS/MS에서 Single Micro-Scans 이상의 증가에 따라 뚜렷한 효과가 없는 것으로 관측했다. 동시에, Micro-Scan 수가 증가할수록 Cycle Time이 증가되었고, 이에 따른 단백질 서열을 확인하는데 감소현상을 보였다. 결국 높은 질의 HCD 스펙트럼을 얻기 위해서는 Single Micro-Scan이 효과적인 것으로 나타났다.
Figure 4와 Table1은 LTQ Orbitrap을 이용하여 정량의 정확도와 1:1.33:1.33:1비로 iTRAQ을 붙인 시료에 대한 단백질 레벨에서 정밀도를 보여주고 있다. 단백질 9개 모두 7%이하의 상대적인 오차 범위 내에서 정량분석 되었다. 보다 중요한 것은 단백질 양적 정확도와 정밀도 둘 다 개별적인 단백질 농도에 영향을 받지 않고, HCD를 이용한 크고 작은 양의 Peptide 확인, 정량을 표시할 수 있다. 유사한 결과로 0.5:1:1:5 비로 iTRAQ을 붙인 시료는 9개 단백질 모두 정량성과 함께 Single Digit의 정밀도와 정확도가 확인하였다. Figure 5는 iTRAQ Reporter Ions이 가장 Intensity가 큰 Fragment Peaks으로 나타났고 실험적인 비가 이론적인 비(0.5:1:1:5)와 정확하게 일치하는 것을 확인하였다.

Orbitrap의 선천 기술인 고분해능과 낮은 화학적인 Noise는 정량 분석을 하는데 있어 큰 장점으로 작용하였다. Figure 6과 같이 MS/MS Scan에서 저 분자량 범위에서 뚜렷한 동중핵의 간섭 이온의 구분은 정량성의 정밀도를 결정할 수 있다. m/z 115.086과 116.070의 동중핵의 간섭 이온들은 iTRAQ Reporter Ions인 m/z 115.108, 116.111로부터 그들을 분리하기 위해서는 11,000 FWHM과 6,000 FWHM의 분해능이 요구된다. Orbitrap 질량분석기의 고분해능은 이들 동중핵의 간섭 이온들을 쉽게 구분하고 정량성의 정밀도를 월등하게 개선시켰다.

Protein Level Quantitation

iTRAQ을 붙인 Peptide 혼합물의 규명과 정량성을 위해 QqTOF와 LTQ Orbitrap 장비의 성능을 비교하였다. 이러한 실험들은 정량성의 정밀도와 정확도를 비교 분석할 때, QqTOF의 느린 Scaning과 낮은 감도에 따른 단점으로 인해, 결과가 현저히 차이나는 것을 방지하기 위해 상대적으로 높은 농도의 간단한 시료로 낮은 Dynamic Range에서 실험하였다. 1:1.33:1.33:1 비로 iTRAQ을 붙인 같은 양의 시료를 Nanospray Ion Source를 사용하여 3번씩 반복 실험하였다. iTRAQ Method는 Vendor에서 추천/제시하는 방법을 따라 QqTOF 장비 제어 소프트웨어를 이용하여 만들었다. LTQ Orbitrap과 QqTOF 둘 다 Mascot 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 이 공인된 소프트웨어는 Vendor들의 특화된 소프트웨어에서 나오는 실험결과의 차이를 최소화하기 위해 선택하였다. 1%의 Ffalse Positive Rate보다 낮게 주어진 Score Filtering를 사용하여 9개의 모든 단백질을 두 장비로부터 확인하였다. Figure 7A에서 보는 바와 같이 LTQ Orbitrap Precursor와 HCD Scans 둘 다 3ppm RMS Mass 정확도로 QqTOF보다 높은 단백질 획득률(Protein Coverage)을 보였다. 정성적인 성능의 차이점은 LTQ Orbitrap의 경우 CID 와 HCD를 동시에 사용하여 얻은 데이터이며, Figure 7B에서 보는 바와 같이 QqTOF에 비해 절대적으로 우수한 결과를 나타냈다. 이 결과는 LTQ Orbitrap과 QqTOF을 10분 동안 1936scans 대 1284scans한 것을 비교로 거의 50%이상 빠르기 때문일 것이다. 즉, Parallel 모드에서 유일하게 Thermo Hybrid MS가 iTRAQ을 이용한 정성, 정량실험에 있어서 타사 MS보다도 탁월한 분석 결과를 제공함을 입증하였다. 단백질의 iTRAQ비는 QqTOF와 Orbitrap에 세 번씩 반복해서 실험하여 정량적인 정확도를 비교 평가하였다. (Table 1B) LTQ Orbitrap은 상대 오차가 7%이하인 범위와 함께 전체적인 정확도를 고려하여 Peptide들을 정량 분석하였다. 반면 QqTOF는 24%이상의 상대 오차범위를 보였다. 비록 모든 정량적인 Peptide를 고려할 수 없을지라도 알고 있는 단백질에 대한 결과를 토대로 실제 시료에 대한 비교평가를 가늠 할 수는 있다.

Peptide Level Quantitation

정량실험의 대부분은 단백질에 상응하는 양의 변화보다 개별적인 Peptide들의 양 변화를 연구하기 위해 실험 Scheme들이 디자인되어진다. 본 연구에서는, 3번의 반복 실험을 통해 Orbitrap과 QqTOF를 사용하여 단일 단백질 내의 Peptide들의 정량적인 정확도와 정밀도를 비교하였다. 두 개의 대표적인 단백질, Bovin Ovalbumin(200fmol)과 Alpha-Lactoalbumin (9fmol)으로부터 변형되지 않은 Peptide들을 Table 2,3에서 두 플랫폼에 정량성의 정확도와 정밀도를 비교하였다. LTQ Orbitrap의 상대오차는 9%이하이며, QqTOF 경우 21%로 비교 분석되었다. 상대표준편차 경우 LTQ Orbitrap이 10%, QqTOF가 26%로 확인되었다. 이러한 결과는 HCD scan이 보다 나은 정밀도와 정확도를 제공한다는 것을 높은 농도의 Ovalbumin과 낮은 농도의 Alpha-Lactoalbumin에 대한 일괄적인 결과를 토대로 명확히 증명된다. 이 결과들은 LTQ Orbitrap의 HCD는 peptide 레벨에서 타사에 비해 4% 이상 RSD가 향상되어 분석적인 정밀도가 제공된다는 제 3 랩의 최근 보고서와 일치한다.