단백질 농도 범위가 9~1040fmol/ul로 구성된 (Chicken Lysozyme at 1040 fmol, Bovine Cytochrome C at 400 fmol, Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase at 240 fmol, Chicken Ovalbumin at 200 fmol, Bovine Carbonic Anhydrase 180 fmol, Horse Heart Myoglobin at 120 fmol, Bovine beta-Casein at 100 fmol, Bovine Serum Albumin at 80 fmol and alpha-Lactalbumin at 9 fmol) 9개의 혼합 단백질을 Digestion하여 이상적인 4개의 Fraction으로 분리하고, 여기에 114, 115, 116, 117의 4개의 iTRAQ Mass Tags를 실험계획안에 따라 1:1.33:1.33:1 또는 0.5:1:1:5의 비로 붙였다. 이 시료는 Desalting 과정을 거치고 난 후, RP C18 Trap 컬럼과 LTQ Orbitrap을 연결하여 LC-MS/MS로 분석하였다. Mothod는 Parallel Mode로 LTQ Linear Ion Trap의 고감도 Data Dependent MS/MS모드와 LTQ Orbitrap의 HCD를 이용한 Data Dependent HCD MS/MS 모드를 각각 3번씩 사용하였다.

Pump: Eksigent® 2D Nano LC
Column: C18 Packed tip, 75 μm  75 mm, C18 Trap
Mobile phase A: 0.1% Formic Acid in Water
Mobile phase B: 0.1% Formic Acid in Acetonitrile
Flow rate: 200 nL/min
Gradient: 10% to 40% B in 30 min

LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) 과 Nanospray Ion Source 조건은 하기와 같이 설정하였다.

MS Resolution: 60 000 FWHM at m/z 400
FT MS AGC target: 5  105
Top 3 HCD MS/MS: at 40% normalized collision energy
MS/MS resolution: 7500 FWHM at m/z 400, 1 microscan
FT MS/MS AGC target: 105, 2 amu isolation width
Monoisotopic precursor selection
Exclusion mass tolerance: 10 ppm
MS/MS threshold: 8000 (~S/N 2:1)
Max IT FT MS: 50 ms
Max IT FT MS/MS: 500 ms
Full MS mass range: 400-2000
MS/MS Mass range: 80-2000
The experiment was run as top three Data Dependent
HCD MS/MS scans in parallel with three Data Dependent
CID MS/MS scans in the LTQ (35% collision energy,
5000 AGC target).

QSTAR Elite (Applied Biosystems, Foster City, CA) 와 Nanospray Ion Source 조건은 하기와 같이 설정하였다.

Biosystems iTRAQ Reagents for Multiplexed Relative and
Absolute Protein Quantification Chemistry Reference
Guide with the following parameters:
Top 3 MS/MS
Charge state selection: 2+, 3+ and 4+
Max MS/MS Time: 250 ms
Full MS mass range: 400-1200
MS/MS Mass range: 100-1500
Quad Resolution: Low
iTRAQ Reagent ‘Enhance reporter region and adjust CE’
function was enabled.

최적화된 LTQ Orbitrap 실험에서는 BioWorks™ 3.3.1 SP1 와 SEQUEST® 을 사용하였다. Lysine에 iTRAQ으로 Modification된 144.10206과 아미노산의 N 말단의 Peptide를 Database Searching에 사용하였다. 규명한 Peptide의 신뢰성을 높이기 위해 다음과 같은 Filtering을 하였다.

Protein probability: 1e-03
Peptide probability: 1e-02
Mass accuracy for parent ions: 5ppm

iTRAQ Reporter Ion들의 정량은 BioWorks 3.3 SP1내의 PepQuan 기능을 이용하여 결과를 처리하였다. LTQ Orbitrap과 QqTOF의 결과를 비교할 때, Mascot™ Software (Matrix Sciences)을 이용하였다. 이때의 조건들은 하기와 같이 설정하였다.

Fixed modifications: Carboxymethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Mass values: Monoisotopic
Protein Mass: Unrestricted
Peptide Mass Tolerance: 5 ppm for LTQ Orbitrap,
0.4 Da for QqTOF
Fragment Mass Tolerance: 0.01 Da for HCD,
0.8 Da for Ion trap, 0.4 Da for QqTOF
Max Missed Cleavages: 3
Database: Swissprot/reverse Swissprot

P<0.001을 적용하여서, 두 장비로부터 얻은 Peptide 규명에 대한 결과는 False Positive Rate가 1%이하의 결과를 얻었다. iTRAQ의 분석에 대해서는, 단백질 비를 중간으로 설정하고 Normalization Method를 사용하지 않고, Automatic Outlier Removal을 사용하였으며, Peptide Threshold의 최소 Score를 1로 설정했다.