Introduction

BRUKER사의 timsTOF Pro(Trapped ion mobility spectrometry quadrupole time of flight)의 PASEF(Parallel Accumulation Serial Fragmentation)기능은 스펙트럼 품질 저하 없이 포커싱된 전구체 이온으로부터 이온 스펙트럼을 보다 빠르게 획득할 수 있게 해준다.
이온 이동도 스캔 동안 사중극자(quadrupole)은 전구체 이온의 포커싱 위치를 여러 번 전환하여 모아진 이온 이동도 Q-TOF 장비에서 특정 이온 종만 분리해 낸다.

Fig.1 PASEF 원리
펩타이드 이온은 100ms 동안 트랩된 다음 MS(m/z, 이온 이동도) 스캔(오른쪽)을 생성한다. MS/MS 스펙트럼(왼쪽) 획득을 위해 동일한 TIMS 분리가 사중극자와 함께 사용되어 이동도가 맞는 시간동안에만 특정 이온을 격리하고 다음 전구체로 즉시 이동하게 된다.

Parallel Accumulation Serial Fragmentation

• MS 스캔으로부터의 전구체 이온이 처음 m/z 및 이동성 차원에 의해 검출될 때, 다음 절편 스캔을 위해 가장 효율적인 방식으로 스케쥴링 되어야 한다.  
• 최적의 측정 순서는 LC 시간 비율로 계산할 수 없는 'travelling salesman problem’에서 가장 짧은 경로로 측정하는 것이다.
• 그러나 일부 조건은 이 전구체 이온 측정 순서를 제한한다.

• 전구체는 한 방향으로만 측정할 수 있다.
• 사중극자의 전환시간(~1ms)으로 인해 연속적인 전구체 측정에 있어 최소의 시간 간격이 발생한다.
• 전구체는 강도에 따라 우선순위가 매겨진다.
• 낮은 강도의 전구체 이온은 여러 번 측정해야 한다.

Result

그림 1 : ImageID 워크 플로우. LC-MALDI와 MS Imaging 데이터를 매치한 후에 결과는 flexImaging 필터 목록을 이용해 각 단백질별로 검출된 모든 펩타이드에 대해 그룹화한다. 일반적인 실험 시간은 FFPE 조직에 대한 항원 복구를 포함하지 않고 8시간이다. (시료 준비 4시간, MALDI 이미징 1 시간(50μm 픽셀에서 35,000 MS 스펙트럼, rat 뇌 코로나 단면) 및 LC-MALDI (384 분획, ~ 5000 MS/MS 스펙트럼) 실험 3시간).

Result

Fig.2 2차원(m/z 와 이온 이동도) 전구체 선택을 위한 알고리즘 흐름
TIMS MS 스캔 전구체는 최적의 순서로 연속 PASEF MS/MS 스캔(일반적으로 사이클 당 ~10~20번)사이에 분포한다. 이 알고리즘은 이론상 시간 계산과 거의 근접하며 추가요구 시간 등의 오류가 거의 없다. 매우 복잡한 protoemics 샘플에서도 계산된 시간이 1ms 을 초과하지 않는다.

Fig.3 LC-MS/MS 실험, 200ng HeLa 샘플, 90min gradient
A) base peak chromatogram.
B) 61.7분의 대표적인 TIMS MS 스캔. 이 스캔에서 41개의 다른 전구체가 다음 10가지 PASEF MS/MS 스캔을 위한 스케줄링 알고리즘에 입력된다. 낮은 농도의 전구체 이온은 다중스캔을 위해 스케줄링 되며 민감도의 저하 없이 119번의 MS/MS 스캔을 진행하였다.
10개의 서로 다른 색깔은 특정 PASEF MS/MS 스캔을 위한 전구체 이온을 연결한다. 가장 풍부한 전구체 이온은 이전 스캔 사이클에서 시퀀싱 되며 재 시퀀싱에서는 유동적으로 제외하여 효율적인 선택을 돕는다.

Fig.4 TIMS-PASEF 를 사용하거나 TIMS 기능을 완전히 꺼둔 상태를 비교한 단백질 ID 결과.

높은 밀도의 전구체 이동 범위에서 PASEF MS/MS 스캔 당 전구체 이온 수 분포. TIMS 스캔 당 평균 10.4개의 전구체 이온이 측정되었으며, 이론적으로 가능한 최대 이온의 수는 14개 (전구체 당 2.8ms 획득시간 및 1.7ms의 전환시간, 1.35 Vs/cm2 사이의 66ms TIMS 간격)이었다.

Conclusion

• TIMS PASEF는 기존의 data dependent MS/MS 에 대해 최대 10배 빠른 속도를 제공한다.
• TIMS PASEF는 TIMS off 실험과 비교하여 분석 시간당 펩타이드 스펙트럼 일치 수를 두 배 이상 증가시키는 것을 확인할 수 있다.