Introduction

MALDI 이미징은 지난 10 년간 조직 섹션에서 직접 잠재적인 바이오 마커를 검출하는 대표적인분석 방법이다. 공간적인 분해를 위한 digestion개발 프로토콜은 특히 중요하다. 그 중 가장 중요한 것은 on-tissue digestion인데 이는 임상병리학에서 가장 흔한 샘플 유형인 파라핀 포매(formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)) 조직에의 펩타이드 분석을 가능하게 하기 때문이다. 또한 펩타이드를 매개로 하여 더 큰 단백질을 검출 할 수 있으며 MS/MS를 통해 바이오 마커 ID를 용이하게 한다.

이 연구에서는 이전에 설명한 ImageID 워크 플로우 (LC-MALDI 및 MALDI 이미징 결합)를 초고속 이미징분석이가능한 10 kHz 레이저가 장착된 새로운 MALDI-TOF/TOF 장비로 새로이 구축하였다. 획득 시간은 10분의 1로 단축되어 전체 실험을 단 하루만에 완료할 수 있다. 이러한 속도를 가진 ImageID 워크플로우는 on-tissue digestion 프로토콜을 평가하고 최적화하는 강력한 도구이다.

Experiment

Sample&Methods

• 조직 섹션(신선한 동결상태 또는 파라핀 포매(FFPE)상태)을 ITO 슬라이드에 장착했다.
• 동일한 슬라이드에 직렬로 2개의 조직 섹션을 올려놓고 하나는 MALDI 이미징 다른 하나는 LC MALDI 실험을 수행하였다.
• TM-Sprayer(HTXTechnologies,USA)또는 ImagePrep (Bruker Daltonik, Germany)를 사용하여 공간 분해 단백질 digestion을 위한 트립신을 처리하였다.
• disgtion 후 하나의 섹션을 동일 분무장비를 사용하여 매트릭스로 코팅하고 rapifleX™ (Bruker Daltonik)으로 이미징을 얻었다.
• 펩타이드는 0.1 % TFA 20 ㎕로 추출하고 nano LC로 분리하였다 (60분 gradient를 사용하여 384 분획으로 분리함).
• LCMALDI분석은 TOF/TOF rapifleX™에서 수행하였다.
• 이미징 및 LC-MALDI 데이터는 ImageID 소프트웨어를 사용하여 모든 스펙트럼의 통계적 재보정 후 손상되지 않은 펩타이드 질량을 기반으로 해석되고 분리된 펩타이드 스펙트럼을 생성하였다 (그림 1).
• 또한, 선택된 펩타이드 ID는 on-tissue MS/MS에 의해 확인할 수 있다 (그림 3).

그림 1 : ImageID 워크 플로우. LC-MALDI와 MS Imaging 데이터를 매치한 후에 결과는 flexImaging 필터 목록을 이용해 각 단백질별로 검출된 모든 펩타이드에 대해 그룹화한다. 일반적인 실험 시간은 FFPE 조직에 대한 항원 복구를 포함하지 않고 8시간이다. (시료 준비 4시간, MALDI 이미징 1 시간(50μm 픽셀에서 35,000 MS 스펙트럼, rat 뇌 코로나 단면) 및 LC-MALDI (384 분획, ~ 5000 MS/MS 스펙트럼) 실험 3시간).

Result

그림 2 : ImageID 결과. 쥐의 뇌 관상면 부분에서 추출한 펩타이드의 LC-MALDI 분석 결과, 뇌 단백질인 Myelin basic protein의 시퀀스 커버리지는 97.9 %였으며 42개의 펩타이드가 확인되었다 (A). 이들 펩타이드 중 30개는 상응하는 MALDI 이미지와 일치 하였다. on-tissue MS/MS에 의해 확인된 6개의 펩타이드 (B-G)의 분포가 나타나 있다. 신뢰도를 높이기 위해 이 6개의 이미지에 대한 Pearson 상관 행렬을 계산한 결과 모든 펩타이드의 높은 상관성을 나타낸다. (H)  *단백질 N- 말단의 변형을 측정 : 메티오닌 제거 후 아세틸 화.

그림 3 : on-tissue MS/MS. LC-MALDI (A, B)에 의해 확인된 펩타이드는 조직 내 동정에 의해 확인되었다. 연속적으로 조직 섹션을 동일한 조건에서 분해하였고 펩타이드 분포를 100 μm 픽셀 크기 (C, D)에서 빠르게 (15분) 이미징으로 시각화하였다.
전체 스펙트럼 (E)에서 명확히 구분되지는 않았던 부분을 rapifleX on-tissue MS/MS(G, H)를 사용하여 두 개의 펩타이드 (Δm / z = 3.077)를 명확하게 구분할 수 있었다.

표. 1 : 조직의 질량 정확도. ImageID로 펩타이드를 확인함으로써 MS 모드의 질량 정확도를 평가할 수 있다. external 보정을 통해 rapifleX는 ~ 25ppm의 뛰어난 질량 정확도를 나타낸다. 통계 재보정 (Mann et al., 1993)을 거치면 질량 정확도를 평균 7ppm까지 늘리는 큰 오류를 수정할 수 있다. 모든 계산은 전체 이미징 실험을 통해 얻은 평균 스펙트럼으로 수행하였다.

그림 4 : FFPE 조직 대 신선한 동결상태 조직. ImageID는 조직 digestion을 평가할 수 있는 강력한 도구이다.
신선한 동결 상태 및 FFPE 쥐 뇌 조직을 비교한 그림. 항원 복구 (110 ℃, pH 6에서 20 분)를 제외하고, digestion 및 매트릭스 도포 (TM sprayer 사용)은 동일하게 시행하였다. FFPE 조직에서 생성된 펩타이드의 수가 적은 것은(신선한 동결상태와 비교하였을 때 376개 또는 37 %) digestion이 덜 효율적임을 나타낸다 (A, B).
또한, 신선한 동결 상태(C, E)에 비해 FFPE 실험 (D, F)에서 측면 해상도의 약간의 손실이 있는데 보이는 것과 같이 항원 복구는 펩타이드의 비편재화를 유도한다. ImageID를 사용하여 LC-MALDI 데이터를 이미징 데이터와 일치 시키면 이미징 데이터의 피크에 23% (235개, 신선 동경결 상태) 및 57% (214개, FFPE)의 LC-MALDI 펩타이드를 할당 하는것이며 이를 통해 매트릭스 도포 동안 펩타이드의 추출 및 병합에 대한 개선이 필요하다는 것을 알 수 있다.

그림 5 : ImagePrep 대 TM sprayer. 인간 유방암 조직 (FFPE)의 연속 절편을 이용한 on-tissue digestion 및 매트릭스 도포 비교. 숙련된 사용자가 두 기기에서 표준 프로토콜을 사용했으며 모든 MS 데이터는 rapifleX에서 동일한 조건으로 수집하였다.
LC-MALDI (370개의 펩타이드 또는 49%) (A, B)에 의해 확인된 펩타이드의 수가 적으며 TM sprayer를 사용한 분해 및 매트릭스 도포 단계가 덜 효율적으로 나타났으며 (A, B) (136 또는 (37%) vs 399 (53%)) 더 높은 펩타이드 질량에서, ImagePrep는 점점 더 강한 신호 강도 (C, D)를 나타낸다. 대조적으로, TM sprayer는 횡 방향 해상도를 크게 향상시킨다. 펩타이드 분포 (E, F)는 해당 조직 특징과 정확하게 일치한다 (G, H).

Summary

• ImageID 워크 플로우를 차세대 MALDI TOF/TOF 플랫폼으로 전환하였다.
• 고해상도 이미지 및 LC-MALDI 데이터와 결합된 MS 모드의 우수한 질량 정확도는 펩타이드 ID 및 분포의 확실한 매칭을 할 수 있다.
• 또한 rapifleX™의 뛰어난 MS/MS 성능은 조직에서 펩타이드를 직접 분석하며 더 나아가 ImageID 일치 확인이 가능하다.
• ImageID를 사용하여 on-tissue digestion 프로토콜의 성능을 평가하고 할당된 펩타이드의 수를 사용하여 프로토콜의 digestion 단계와 매트릭스 침착 단계를 분리하였다.

Conclusion

• 조직 이미징 및 펩타이드 확인을 포함한 전체 워크 플로우를 하루 안에 끝낼 수 있다.
• On-tissue MS/MS를 사용하여 ImageID 일치 결과를 확인하였다.
• rapifleX™의 imageID 워크 플로우는 on-tissue digestion 평가를 위한 매우 효율적인 도구이다.