Purpose: Biopharmaceutical Applications을 위한 새로운 Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS를 이용한 다중 선택이온분석법이(Multiplexed Selected Ion Monitoring, SIM) 소개.
Methods: 유속 150 μL/min으로 10분 동안 LC 조건을 이용한 질량분석학은 열 전자분무이온화 소스(Heated Electrospray Ionization (HESI) Source)를 장착한 Benchtop Quadrupole - Orbitrap LC-MS/MS를 이용하여 폭넓은 선택이온분석법으로 실행.
Results: 일반적인 방법을 개발하기 위해 샘플로 Insulin, Exendin-4 과 GLP-1 Peptide를 사용하여 농도 범위 10 pg/mL 와 10 μg/mL 사이에서 우수한 직진성을 가지고 재현성있게 분석됨을 확인.

Q ExactiveTM는 Benchtop MS/MS Orbitrap으로, Quadrupole Mass Filter가 탑재되어 Selected MS/MS가 가능하다. 이와 함께 Orbitrap 의 선천적인 장점인 High-Resolution 과Accurate-Mass(HR/AM)의 능력이 더욱 향상되어 기존의 Q-TOF보다 훨씬 손쉽고 정확하게 정성/정량 분석을 할 수 있다. 또, 새로워진 C-Trap Ion Optics 과 HCD Collision Cell은 매우 정확하고 빠른 HCD MS/MS Scanning 이 가능하여 극미량의 단백질이나 대사체 샘플들에 대해 우수한 재현성으로 신뢰성 있으며 또한 보다 정확한 정성/정량 분석 결과를 얻을 수 있다.

생체의약품 분석에 있어서, 기존의Triple Quadrupole MS는 Peptide 정량분석을 위한 시스템으로 탁월하게 사용되어왔다. 비록Triple Quadrupole MS는 우수한 감도로 정확한 정량분석을 할 수 있지만, Fragmentation의 정보가 다소 부족하고 다중 전하의 분자량인 Large Peptide의 경우 MS/MS한 딸이온을 선택이온분석법 (Selected Reaction Monitoring, SRM)을 이용하기에 시그널이 약하기 때문에 분석에 어려움이 있다. 본 연구에서는, 새로운Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS에서 제공하는 다중 선택이온분석법 기능을 활용한 새로운 시도로 생물체의 매트릭스 속에서 Peptide의 정확하고 정밀한 정량분석 결과를 얻어 그 성능의 탁월함을 증명하였다.

Sample Preparation
Calibration Curves는 쥐의 혈장에서 준비하였다.

Liquid Chromatography (Generic Separation)
Thermo Scientific사의 UHPLC인 Accela LC 시스템을 이용하여 Hypersil GOLD (100×1mm, 1.9 μm) 컬럼으로 유속 150 μL/min의 조건으로 분석하였다. 이동상은 0.1% Formic Acid가 첨가된 Water와 Acetonitrile을 사용하였다.
Mass Spectrometry
질량분석기는 Figure 1과 같은 Thermo Scientific사의 Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS인 고성능 Q ExactiveTM을 이용하여 분해능 70,000(Maximum 140,000 Resolution at m/z 200)에서 다중 선택이온분석법으로 실험하였다. 선택한 다중 선택이온분석법은 지정한 스캔 범위에서 많은 이온들을 C-trap에서 채운다. C-trap에서 포집한 이온들과 사전에 포집한 이온은 Orbitrap에서 분석한다. 본 연구에서 사용한 샘플, 세가지 종류의 Peptide들에서 사용된 Isolation Window는 20amu이다. 최대한 감도를 높이기 위해서 AGC Target Value를 최적화 하였고, 분석하고자 하는 각 Peptide들의 Source 조건은 아래와 같이 설정하였다.

Heater Temperature 200 ºC, Capillary Temperature 275 ºC, Spray Voltage 3.5kV, Sheath Gas 40, Aux Gas 10.

Data Analysis
데이터는 Thermo Scientific사의 LCQUAN 정량분석 소프트웨어를 이용하여 정확도 5ppm에서 처리하였다.


Figure 1. Schematic of the Q Exactive benchtop
quadrupole-Orbitrap mass spectrometer.