Purpose: Biopharmaceutical Applications을 위한 새로운 Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS를 이용한 다중 선택이온분석법이(Multiplexed Selected Ion Monitoring, SIM) 소개.
Methods: 유속 150 μL/min으로 10분 동안 LC 조건을 이용한 질량분석학은 열 전자분무이온화 소스(Heated Electrospray Ionization (HESI) Source)를 장착한 Benchtop Quadrupole - Orbitrap LC-MS/MS를 이용하여 폭넓은 선택이온분석법으로 실행.
Results: 일반적인 방법을 개발하기 위해 샘플로 Insulin, Exendin-4 과 GLP-1 Peptide를 사용하여 농도 범위 10 pg/mL 와 10 μg/mL 사이에서 우수한 직진성을 가지고 재현성있게 분석됨을 확인.

Q ExactiveTM는 Benchtop MS/MS Orbitrap으로, Quadrupole Mass Filter가 탑재되어 Selected MS/MS가 가능하다. 이와 함께 Orbitrap 의 선천적인 장점인 High-Resolution 과Accurate-Mass(HR/AM)의 능력이 더욱 향상되어 기존의 Q-TOF보다 훨씬 손쉽고 정확하게 정성/정량 분석을 할 수 있다. 또, 새로워진 C-Trap Ion Optics 과 HCD Collision Cell은 매우 정확하고 빠른 HCD MS/MS Scanning 이 가능하여 극미량의 단백질이나 대사체 샘플들에 대해 우수한 재현성으로 신뢰성 있으며 또한 보다 정확한 정성/정량 분석 결과를 얻을 수 있다.

생체의약품 분석에 있어서, 기존의Triple Quadrupole MS는 Peptide 정량분석을 위한 시스템으로 탁월하게 사용되어왔다. 비록Triple Quadrupole MS는 우수한 감도로 정확한 정량분석을 할 수 있지만, Fragmentation의 정보가 다소 부족하고 다중 전하의 분자량인 Large Peptide의 경우 MS/MS한 딸이온을 선택이온분석법 (Selected Reaction Monitoring, SRM)을 이용하기에 시그널이 약하기 때문에 분석에 어려움이 있다. 본 연구에서는, 새로운Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS에서 제공하는 다중 선택이온분석법 기능을 활용한 새로운 시도로 생물체의 매트릭스 속에서 Peptide의 정확하고 정밀한 정량분석 결과를 얻어 그 성능의 탁월함을 증명하였다.

Sample Preparation
Calibration Curves는 쥐의 혈장에서 준비하였다.

Liquid Chromatography (Generic Separation)
Thermo Scientific사의 UHPLC인 Accela LC 시스템을 이용하여 Hypersil GOLD (100×1mm, 1.9 μm) 컬럼으로 유속 150 μL/min의 조건으로 분석하였다. 이동상은 0.1% Formic Acid가 첨가된 Water와 Acetonitrile을 사용하였다.
Mass Spectrometry
질량분석기는 Figure 1과 같은 Thermo Scientific사의 Benchtop Quadrupole - Orbitrap MS인 고성능 Q ExactiveTM을 이용하여 분해능 70,000(Maximum 140,000 Resolution at m/z 200)에서 다중 선택이온분석법으로 실험하였다. 선택한 다중 선택이온분석법은 지정한 스캔 범위에서 많은 이온들을 C-trap에서 채운다. C-trap에서 포집한 이온들과 사전에 포집한 이온은 Orbitrap에서 분석한다. 본 연구에서 사용한 샘플, 세가지 종류의 Peptide들에서 사용된 Isolation Window는 20amu이다. 최대한 감도를 높이기 위해서 AGC Target Value를 최적화 하였고, 분석하고자 하는 각 Peptide들의 Source 조건은 아래와 같이 설정하였다.