Fluorescence Spectrometer, Luminescence Microcell Holder, Bioluminescence, Luciferase, Quantum Dot, Biolumenescence Resonance Energy Transfer (BRET)

분자간의 에너지 전달은 전자기파에 의한 복사전이로 일반적으로 이루어진다. 하지만 다른 종류의 형광체가 수 A 단위로 가까워지면 복사전이 없이 공명에 의해 에너지가 전달되는 공명에너지전이 (RET, Resonance energy transfer) 현상이 발생한다. 대표적인 RET 현상으로는 FRET (Forster resonance energy transfer)이 있다.

FRET에서는 에너지 전달자인 donor를 들뜨게 하기 위해 강한 빛을 직사하는데, 이 과정에서 의도치 않은 여러 잡광들이 발생한다 (그림 1). Donor에서 공명으로 전이되고 남은 에너지가 빛으로 방출되고 (Bleed-through), acceptor나 생체물질에 존재하는 자연 형광체들이 직사된 빛을 맞아 누설광 (Cross-talk)과 자가발광 (Autofluorescence) 등의 원하지 않는 빛을 유발한다. 또한 강력한 직사광에 의해 형광성질을 서서히 잃는 광표백 (Photobleaching) 현상도 문제를 일으킨다.

그림 1. FRET과 잡광 발생의 도식

최근에는 감도를 높이기 위해 FRET을 보완하여, donor를 생물학적 발광 물질로 대체한 BRET (Bioluminescence resonance energy transfer)을 사용한다.1 BRET은 직사광이 없어 누설광과 자가발광의 생성을 차단하고 광표백 현상을 막아준다 (그림 2).

그림 2. BRET과 잡광 차단의 도식

BRET에서는 donor를 반딧불의 발광 효소로 널리 알려진 루시페라아제 (Luciferase)를 주로 사용한다.2 이번 실험에서는 바다 팬지 (Sea pansy, Renilla reinformis)라는 해조류에서 추출한 루시페라아제를 유전자 변이시킨 Luc8 (Renilla luciferase 8)을 사용했다. (그림 3) Luc8은 그림 4와 같이 480nm 부근에서 넓은 생체 발광 스펙트럼을 보인다.

그림 3. 바다 팬지 (좌)와 Luc8의 구조 모델 (우)

그림 4. Luc8의 방출 Spectrum

Acceptor는 donor의 발광 파장에 따라 정해지는데, 이번 실험에서는 형광 수율이 좋고 다양한 형광 파장을 갖는 Quantum Dot 중 605, 655, 705, 800, 4종류를 사용하였다3 (그림 5). 이 Quantum Dot들은 넓은 파장대에서 빛을 흡수하여 각각 605, 655, 705, 800 nm에서 최대 값을 갖는 형광 스펙트럼을 보인다.

그림 5. Quantum Dot의 구조 (좌)와 발색 (우)

강한 직사광에 의해 발생하는 형광에 비하여 자연 발광 (Luminescence)은 빛의 세기가 상대적으로 낮다. 더욱이 마이크로 셀을 사용한 실험은 그 빛의 양이 더 적어 진다. 따라서 BRET 현상 측정 시 빛을 최대한으로 포집하기 위해 microcell과 emission lens와의 거리를 최소화시킨 Luminescence Microcell Holder 액세서리를 사용하여 실험하였다 (그림 6).

그림 6. 일반 Microcell Holder (좌)와
Luminescence Microcell Holder (우)의 비교