1. Fluorescence Spectrometer (FS-2)
2. Luminescence Microcell Holder
3. PBS Buffer Solution 0.1M (pH 7.4)
4. Luc8 150μM
(한양대학교 생명과학과 김영필 교수님께서 제공)
5. Quantum Dot 605, 655, 705, 800 8μM
(Invitrogen)
6. Coelenterazine H 1μg/μl in methanol (Promega)
7. NiCl2 100μM in distilled water (Sigma Aldrich)
8. 10μl Eppendorf Tubes
9. 45μl Fluorescence Microcell
10. Pipette & Pipette Tip
11. Vortex Mixer

1. 10μl Eppendorf tube를 4개에 준비한다.
2. 각각의 tube에 PBS buffer를 94μl, donor인 Luc8을 1μl씩 넣는다.
3. Acceptor인 Quantum Dot 605, 655, 705, 800을 tube마다 각각 5μl씩 넣는다.
4. Donor와 acceptor의 결합촉진제인 NiCl2 용액을 모든 tube에 2μl씩 넣고 vortex mixer를 이용하여 충분히 혼합시켜준다.
5. FS-2에 Luminescence Microcell Holder를 설치한 후, 시료를 마이크로 셀에 주입하고, 마이크로 셀을 셀 홀더에 넣는다
6. FluoroMaster Plus Software의 Wave Scan을 실행 시킨 후, 설정 값을 입력하고 Apply 버튼을 눌러 설정 값의 상태로 장비를 대기시킨다 (그림 7).
7. Pipette을 이용하여 coelenterazine H를 2μl 넣어주고, 주입과 동시에 cell compartment의 덮개를 닫고 Start 버튼을 눌러 각각의 시료에 대해서 스펙트럼을 측정한다.
8. 측정한 Data들에 Baseline Correction을 해준다. 화면 상단에 있는 Baseline Correction 아이콘을 선택한 후, 제일 낮은 형광 세기가 나온 파장을 기준으로 Baseline을 보정한다 (그림 8).
9. 보정한 Data들을 Luc8을 기준으로 표준화하여 Quantum Dot의 데이터들을 비교한다. 모든 스펙트럼들의 Luc8의 peak 값이 일치되도록 환산 값을 계산 한 후, 화면 상단에 있는 Scalar Calculator 아이콘을 선택하여 환산 값을 곱해 표준화시켜 데이터를 비교한다 (그림 9).


그림 7. Wave Scan 측정 조건


그림 8. Baseline Correction 화면


그림 9. Scalar Calculation 화면