본 연구에서는 차 종류에 잠재적으로 건강에 유익한 성분이 포함되어있다는 것을 밝히고, 특히 노화방지제와 polyphenolic catechins, theaflavins 성분의 특성에 대해 분석하고자 했다(그림 2). 본 연구는 녹차와 홍차 시료의 낮은 분자량의 성분을 검출하고 상대적인 양 또한 비교분석을 하였다.

그림2) Camellia sinensis leaves로부터 3가지 종류의 차를 제공받았다. 녹차(nonfermented), 우롱차(semi-fermented)와 홍차(fermented).
Catechins은 차 종류의 식물에서 가장 많이 존재하는 소위 Flavan-3-ols이라 불리는 플라보노이드 종류의 polyphenolic antioxidant plant 대사산물이다. 발효는 flavam-3-ols의 산화효소를 이용하여 홍차안에 theaflavins(TFs)와 thearubigns(TRs)의 두 주요한 색소를 형성시켰다. Catechins는 녹차와 홍차의 theaflavins에 더 많이 함유되어 있는 것으로 볼 수 있다. 예상되는 fragmentation pathway로는 Retro-Diels-Alder rearrangement를 거쳐 진행된다고 볼 수 있다.

Tea 샘플들의 HPLC 분리는 10분 안에 뚜렷한 분리와 낮은 노이지를 보여주었다. 고분해능 full scan spectra는 질량 정확도가 3ppm이하에서 얻었다.
모든 데이터를 얻은 후에, SIEVE software를 이용하여 녹차와 홍차시료의 대사산물에서 통계적으로 확연히 차이를 보이는 성분을 검출하였다(그림 3).

그림3) SIEVE software를 이용하여 대사산물의 양적인 차이를 비교하였다.
A) 같은 시료를 여러 번 찍은 두 시료를 SIEVE software에서 크로마토그래피를 정렬한 것이다. 녹차(blue)와 홍차(red)사이에서 차이점을 발견하였다. ThermoFisher Scientific사의 Accela UHPLC는 고 분해능과 높은 S/N비를 제공하여 뚜렷한 분석에 질을 높였다.
B) 정렬 이후에, 녹차와 홍차에서 서로 상응하는 peak intensity로 비교하였다. 여러가지 성분들의 상대적인 양적 비교는 그들의 함유량의 차이비율을 보여주는 것과 같다. 이 대사산물들은 고정확의 질량값으로 구성성분을 확인하고, MassFrontier software를 통해 MSn 데이터를 해석하였다.

두 샘플의 크로마토그래피 사이에 peak intensity로 비교/정렬하여 녹차와 홍차 사이에 서로 다른 레벨의 대사산물을 검출하였다.
대사산물의 양적인 차이를 보이는 것을 확인한 다음, 고정확도의 질량값과 MSn 데이터를 통해 구조적인 정보를 얻었다. Elemental formula는 고정확도 질량값으로 결정하고, 이 고정확도의 질량값은 대사산물을 찾는데 유용하게 이용되었다. 검증시약으로 EGCG의 대사산물을 선정하여 이러한 방법을 이용하여 확인하였다.
나아가 대사산물의 구조적인 특징은 MSn spectra와 MassFrontier software를 이용하여 밝혀낼 수 있다. MassFrontier software는 포괄적인 spectral library와 100,000개 이상의 fragmentation library를 포함하고 있어 구조를 밝히는데 예상되는 fragmentation 알고리즘은 제공하여 정확한 대사산물을 확인하는데 이용될 수 있다(그림 4). 그림 3에서는 화합물을 이 같은 workflow를 이용하여 규명하였다.

그림4) 그림3으로부터 흥미있는 대사체를 선택하여 구조를 밝히는 작업을 하였다. 이 이온은 홍차를 3번씩 찍어서 유력한 노화방지제인 EGCG로 확인하였다. 고정확도의 질량값은 이러한 성분의 elemental composition을 예상할 수 있게 정보를 제공하였고, 어미이온의 fragmentation spectra(MSn)정보는 MassFrontier software를 이용하여 이 성분이 EGCG인 것을 규명/확인하였다.