Purpose: Capillary Ion Chromatography(Cap IC)와 High-Resolution/Accurate-Mass(HRAM) MS를 연동해서 Untargeted Metabolomics Research Analysis와 Isobaric Metabolites를 식별할 수 있는 유일한 방법을 소개하고 한다.
Methods: Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-4000 Capillary IC System과 연동된 Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer로 Cell Lysate 검출과 Differential Analysis를 했다.
Results: Metabolites는 S/N 3-20 범위에서 최저 농도 60 ppt (0.2 to 3.4 fmol on Column)를 검출했고, LODs는 0.04~0.5 nmol/L 범위로 검출했다. Anionic Polar Metabolites를 눈에 띄게 분리하고 보다 우수한 분석적인 감도를 Reversed-Phase Liquid Chromatography (RPLC)와 Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)으로 비교했다.
Metabolomics Approach에 있어 구강 암(Oral Cancer) 연구는 최근 많은 연구자들에게 중요한 관심분야가 되었다. 본 연구에서 보다 우수한 분석적인 결과를 얻기 위해 Cap IC와 Q Exactive MS를 연동한 방법을 개발했고, Cell Lysates로부터 Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) Metastasis에 Potential Metabolic Biomarkers Profiling을 적용시켰다. Cap IC는 RPLC와 HILIC보다 Anionic Polar Metabolites를 눈에 띄게 잘 분리했고 우수한 분석적인 감도도 함께 제공했다. Differential Analysis는 Energy Metabolism Pathways에서 뚜렷한 변화를 찾아냈고, Glycolysis Cycle과 Tricarboxylic Acid Cycle을 그 예로 들 수 있다. Polar Metabolites의 보다 높은 분리능과 분석적인 감도를 제공하는 Cap IC는 Isobaric Metabolites를 식별할 수 있는 High-Resolution/Accurate-Mass인 Q Exactive와 연동하였을 때 보다 쉽고 정확하게 측정 할 수 있었다.
Sample Preparation
세 개의 OSCC Cell Lines, UMSCC1, UMSCC5, Cancer Stem-Like Cells (CSC)은 Wild-Type Controls에 따라 생물학적인 중복실험을 계산하여 준비했다. Cellular Metabolites는 Liquid Nitrogen Snap-Freezing Method와 문헌에 따라 Methanol/Water를 사용하여 추출했다.
Ion Chromatography and Liquid Chromatography
Cap IC Analysis는 Thermo Scientific™ Dionex™ IonPac™ AS11HC-4μm, 0.4 x 250 mm Column으로 분리했다. IC 유속은 25 μL/min이고, 보조적으로 Post-Column은 Methanol /Acetic acid (2 mM)을 10 μL/min으로 흘렸다. 2 mM Potassium Hydroxide을 Gradient 시작으로 13.5min에 12mM로 올린 뒤, 22.5min에 20mM과 31.5min에 70mM로 했다. 6min동안 70mM로 흘려준 뒤, 0.1min안에 2mM로 낮춘 뒤 7.5min간 흘려 컬럼을 Re-Equilibrate시켰다. HILIC은 유속 250 μL/min으로 150 x 2.1 mm, 5 μm SeQuant®- ZIC®-pHILIC Column을 사용했다. UHPLC는 유속 450 μL/min으로 Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ 150 x 2.1 mm, 1.9 μm Column을 사용했다. LC는 Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 RSLC HPG System을 사용했다.
Mass Spectrometry
Q Exactive Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer는 ESI Negative Mode에서 모든 데이터를 검출했다. Resolving Power 70,000 (at m/z 200), Automatic Gain Control (AGC) 1 x 106 Ions과 Maximum Ion Injection Time (IT) 50ms 조건에서 Full Mass Scan(m/z 67-1000)을 실행했다. Data-Dependent MS/MS는 다음과 같은 조건에서 “Top10” Data-Dependent Mode로 데이터를 획득했다.
Parameters |
Value |
Resolving Power |
17,500 |
AGC |
1 x 105 Ions |
Maximum IT |
100ms |
Isolation Window |
1.5 amu |
Normalized Collision Energy |
35% ± 50% |
Underfill Ratio |
1.00% |
이온화 소스의 파라미터는 상이한 유속에 따라 최적화 시켰고, Capillary Flow IC는 다음과 같은 조건에서 실행했다.
Parameters |
Value |
Spray Voltage |
(-)2.8 kV |
Transfer Capillary Temperature |
300 ºC |
S-lens level |
50 |
Heater Temperature |
125 ºC |
Sheath Gas |
26 |
Aux Gas |
2 |
보다 높은 유속에서의 LC는 다음과 같은 조건에서 실행했다.
Parameters |
Value |
Spray Voltage |
(-)3.2kV |
Transfer Capillary Temperature |
275 ºC |
Sheath Gas |
45 |
Aux Gas |
5 |
Data Analysis
Differential Analysis는 Thermo Scientific™ SIEVE™ Software Version 2.1을 사용하여 분석했다. 통계학의 결과, Putative IDs와 Pathways는 ChemSpider® 와 KEGG™ 을 데이터베이스로 실행했다. 관심 있는 Metabolites는 MS/MS Mass Spectral Database Matching을 거쳐 확인했다. Raw Data는 ProteoWizard를 이용하여 mzXML로 전환하고 XCMS Online과 metaXCMS으로 분석했다.
그림 1. Untargeted Metabolic Profiling을 위한
Capillary IC-Q Exactive의 회로도 
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