Evaluation of Detection Limits and Linear Dynamic Range of the DIA Workflow
본 DIA Workflow의 검출한계와 정량적인 Dynamic Range는 5개의 서로 다른 농도에(0.01 fmol/μL, 0.1 fmol/μL, 1fmol/μL,10 fmol/μL and 100 fmol/μL) 7개의 Isotopically Labeled Yeast Peptides인 E. coli Digests (500 ng/μL)를 첨가한 혼합물로 평가했다.
Full Mass Range의 모든 Precursor Ions을 분리한 상이한 Full MS, 200 amu Isolation Window의 SIM Scan은 관심 있는 Mass Range를 제외한 All Precursor Ions를 이용하여 "Enriches"하는데 효과적이다. 이 방법의 정량 분석 최저 한계는 Trapping Column에서 선택적으로 수집한 Peptides와 같은 방법보다 훨씬 우수한 결과를 얻었다. 결과적으로, SIM Scan은 그림 4와 같이 폭넓은 Isolation Window라도 Full MS와 비교 시 낮은 농도의 Peptide에서 보다 높은 감도를 제공할 수 있었다.
5개 첨가한 Isotopically Labeled Peptides와 BSA는 그림 5와 같이 10 attomol의 검출한계와 4 Order의 Linear Dynamic Range로 측정되었다.

그림 4. Full MS와 SIM의 선택성과 감도 비교  

그림 5. Orbitrap Fusion MS를 이용한 DIA Workflow는 10 attomol의 LOD와 4 Order의 Linear Dynamic Range를 제공한다.  

Detecting and Quantifying Low-abundance and High-abundance Spiked Proteins with the DIA workflow in a Single Experiment
Dynamic Abundance Levels에 있는 6개의 Bovine Protein Digests에 500 ng E. coli matrix를 첨가했다. 낮은 농도의 샘플에는, BSA를 10 attomles의 농도로 첨가했고, 고농도의 샘플에는 Beta-Lactoglobulin Protein을 1pmol에 되게 첨가했다. 샘플은 Thermo사에서 개발한 DIA Workflow를 사용하여 세 번씩 반복 측정했다. HR/AM SIM은 5 Orders의 Dynamic Range에서 6개를 첨가한 단백질 모두를 재현성있게 검출하는데 높은 감도, 높은 선택성과 폭넓은 Dynamic Range를 제공했다. Table 1은 첨가된 단백질에 의하여 검출된 Peptide와 측정된 %CVs를 요약한 것이다.

Table 1. 한번 실험으로 5 Orders의 Dynamic Concentration에 500ng E.Coli 매트릭스를 첨가한 6 Bovine Proteins의 정량분석  

Detecting and Quantifying a Large Number of Proteins of Interest with the DIA
Workflow in a Single DIA Experiment.
6개 첨가된 Bovine Proteins을 정량분석하기 위해 세 번씩 동일하게 획득한 DIA 데이터 파일은 Thermo Scientific™ Protein Center™ 소프트웨어에 의해 Annotation Results를 바탕으로 한 Metabolic Pathway와 함께 172 E.Coli Proteins을 추가적으로 정량 분석하는데 사용되었다. 771 Peptides는 그들의 172 Proteins을 기술하기 위해 정량 분석을 했다. 우수한 분석의 정밀도는 그림 6과 같이 측정되었다. 정량된 Peptides의 69%가 10% 이하의 %CVs 값을 가졌고, 88%는 15%이하의 %CV를 가졌다. 정량된 Peptides 모두 20%의 CVs로 측정되었다.

그림 6. HR/AM SIM과 DIA Workflow를 이용한 다수의 Targeted Proteins의 정량결과에 우수한 분석의 정밀도

Thermo사의 유일한 DIA Workflow은 새로운 Orbitrap Fusion MS를 이용하여 HR/AM SIM과 Rapid CID MS/MS을 Parallel Mode로 동시에 획득할 수 있도록 개발되었다. HR/AM SIM으로 검출된 Precursor Ions은  XIC(± 5 ppm)으로 정량 분석했고, Targeted Data Extraction을 적용해서 얻은 CID MS/MS를 이용하여 동시에 정확한 확인을 수행했다.
SIM으로 얻은 Precursor Ions과 240,000의 매우 높은 분해능은 분석물질과 주위 방해물질을 손쉽게 분리하여 높은 감도와 높은 선택성으로 겸비한 정량분석을 할 수게 도와준다. Thermo사가 개발한 DIA Workflow는 Orbitrap Fusion을 이용하여 10 attomole의 검출한계와 4 Orders의 Linear Dynamic Range를 얻는데 성공했다.
한번의 실험으로 6 Proteins의 5 Orders 이상의 넓은 농도 범위의 양을 우수한 분석결과로 정밀도와 함께 검출 및 정량 분석하였다.
172 E. coli Metabolic Pathway Proteins이 묘사된 771 Peptides 또한 동일한 실험에서 우수한 정밀도와 정확성을 가지고 검출 및 정량 분석하였다.