Purpose: Large Scale Targeted Protein의 보다 정확한 정량분석을 하기 위해서 Orbitrap Fusion™ Tribrid™ 질량분석기를 이용하여 높은 감도와 높은 선택성을 제공하는 Data Independent Acquisition(DIA)분석법을 개발하고자 한다.

Methods: 본 실험에서의 DIA 분석법은, 400 – 1000m/z 의 범위를 200amu의 넓은 범위인 Isolation Window로 세 구간을 나누어 높은 분해능(240,000 FWHM)과  높은 정확도의 Selected Ion Monitoring (SIM)으로 스캔 했다. 각 SIM 스캔과 Parallel 모드로, 200amu의 SIM 구간마다 12 amu의 Isolation Window로 17구간으로 나누어 Ion Trap MS/MS를 이용하여 연속적으로 스캔 했다. 한번 시료 주입으로 세 구간의 연속적인 SIM스캔에 있는 모든 Precursor Ion들의 정량적인 정보를 제공하고자 한다. 아울러, 400 – 1000m/z 의 질량범위에서의 모든 MS/MS 정보는 Spectral Library에 있는 Querying Specific Fragment Ions에 의해 모든 Peptide의 Sequence Confirmation이 표시된다. 정량적인 성능과 이 새로운 방법의 처리량은 다양한 샘플을 이용하여 평가되었다.

Results: SIM 스캔으로 얻은 데이터는 높은 분해능으로 Peptide 시그널로부터 매트릭스를 손쉽게 분리함으로써 매우 낮은 농도에서 조차 Targeted Peptide로 명백하게 검출할 수 있었다.
500 ng E. coli Digest Matrix에  첨가한 Isotopically Labeled Stadards는 검출한계(LODs)가 10 attomole로 검출하였고, 4 Orders의 Linear Dynamic Range에서 매우 정밀하게 측정하였다. 높은 재현성과 정확한 정량결과는 DIA로 얻은 후 Target Data Extraction을 적용해서 수행했다.

Proteomics 연구는 생물학 시스템에서 생물학적인 기능과 단백질의 상호관계를 이해하기 위해 정성분석에서 정량분석으로 이어지고 있는 추세이다. 전형적인 샘플에서의 단백질의 Dynamic Range와 Extreme Complexity는 재현성과 고급 샘플정보를 얻기 위해 매우 빠른 MS/MS 획득이 요구된다. 최근, 여러 DIA 분석법들은 보다 우수한 정량분석을 하기 위해 높은 재현성과 포괄적인 정보를 개발하는데 접근해 왔다. 정량분석을 위해 25Da의 Isolation Window로 HR/AM MS/MS Data를 획득한 것으로부터 Targeted Extracted Fragment Ions을 사용했다. 정량적인 성능은 Co-Eluted Background Compounds로 부터 Interfering Fragments를 제거할 수 있는 능력에 있다.

Orbitrap Fusion Tribrid MS은 그림 1과 같이 Quadrupole, Orbitrap Analyzer, Collision Cell과 linear Ion Trap (Q-OT-qIT)으로 구성되어있다. Orbitrap Detector는 분해능 240,000에서 0.5초 이하로 데이터를 획득 할 수 있다. Linear Ion Trap은 1초에 20번 이상 MS/MS(CID) 데이터를 획득 할 수 있다. 이와 같은 유일한 구성은 Orbitrap SIM과 매우 빠른 Targeted Ion Trap MS/MS을 동시에 측정할 수 있어 Duty Cycle을 최대한 활용할 수 있다. 우리는 그림 2와 같이 HR/AM SIM과 Collision-Induced Dissociation (CID) MS/MS을 동시에 측정해서 얻는 새로운 개념의 DIA 방법을 개발하였다. 데이터 획득 이후 Targeted Proteins의 정량은 HR/AM Full MS SIM 데이터로 수행했고, 동시에 Spectral Library로 부터 예측 가능한 Retention Time에 있는 CID MS/MS를 이용해서 Peptide Sequence Confirmations을 수행했다. 분해능 240,000에서 HR/AM SIM스캔으로부터 얻은 Precursor Ions은, 이 새로운 DIA 방법으로 Background로부터 어떠한 방해 없이 Peptide Peaks을 손쉽게 분리해서 정량할 수 있게 되었고, 높은 감도와 높은 선택성을 동반한 재현성 있는 정량분석을 정확하게 할 수 있게 되었다. DIA Workflow의 상세한 내용은, Thermo Scientific™ Pinpoint™소프트웨어를 이용하여 자동으로 정량분석을 할 수 있게 데이터 처리를 했다.

Sample Preparation
Sample 1: 7개의 Isotopically Labeled Yeast Peptides의 혼합물은 서로 다른 농도에(0.01 fmol/μL, 0.1 fmol/μL, 1 fmol/μL, 10 fmol/μL, 100 fmol/μL) BSA 또는 E. coli Digest (500 ng/μL)를 첨가했다.
Sample 2: 6개의 Protein Digests의 혼합물은 5가지의 농도에 (0.01 fmol/μL, 0.1 fmol/μL, 1 fmol/μL,10 fmol/μL, 100 fmol/μL, 1000 fmol/μL) E. coli Digest (500 ng/μL)를 첨가했다.

Nano-LC
Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1000과 Thermo Scientific™ EASY-Spray™ PepMAP C18(2um, 75um x 50cm) 컬럼을 이용하여 하기와 같은 조건에서 분리했다. 샘플은 컬럼에 1ul 직접 주입을 했다.
유속: 300nL/min, 이동상 A: 0.1% FA/H2O, 이동상 B: 0.1% FA/ACN
Gradient: 5% B에서 25%로 100min, 25%에서 35%로 20min 분리

MS
모든 실험은 Orbitrap Fusion MS과 Thermo Scientific™ EASY-Spray™ 소스를 사용했고, 하기와 같은 조건에서 실험했다.
Capillary temperature: 275 ºC; Spray voltage: 1800 V.
FT SIM: Resolution: 240,000; AGC target : 2+E04; Isolation width(Trap): 200 amu.
CID MS/MS: Rapid CID MS/MS, AGC target : 1+E04; Isolation width(Q): 12 amu.
6개의 Scan Events: 3개의 SIM scan event는 1,3 그리고 5에서 수행했고, 각 SIM scan은 그림 2와 같이 Precursor Ion Inclusion List를 이용하여 17구간을 연속적으로 CID MS/MS를 수행하는 하나의 tMSn 스캔에 따라 실험했다.

그림 1. Orbitrap Fusion MS의 구성  

그림2. HR/AM SIM(R 240K)과 12Da  Isolation Width의17 Sequential CID MS/MS를 동시에 검출하는 DIA Workflow  

Data processing
Pinpoint 1.3 소프트웨어는 Targeted Qualitative와 데이터 획득 이후에 Data Extraction으로 정량분석에 하기에 적합하다. Spectral Library는 Orbitrap Fusion MS로 이전에 발표된 데이터를 이용하여 확인했다. Targeted Peptide에 의하여 Isotope C12와 C13의 XIC는 ± 5 ppm으로 정량분석 하는데 사용했다. 8개의 감도가 큰 Fragment Ions(b 와 y types)은 Spectral Library와 일치한 것을 바탕으로 데이터를 검출했다. 0.1(Library Spectra와 일치)보다 작은 P-value의 Peptide는 그림 3과 같이 Spectral Library Match에 의해 높은 신뢰성을 바탕으로 데이터 처리가 된 것을 확인할 수 있다.

그림 3. 낮은 P-Value로 정확한 Peptide(RT 15.3min)와 유사한 오염물질(RT 16min)을 Pinpoint 1.3 소프트웨어를 사용하여 정성분석과 정량분석을 동시에 수행해서 정확하게 확인했다.